Intracellular proteins implicated in the migration of cortical neurons

Resumen

Antecedentes y estado actual del tema: La corteza cerebral en el cerebro adulto está compuesta mayoritariamente por dos tipos neuronales: las neuronas de proyección y las interneuronas. Las primeras aportan el componente excitatorio y sus conexiones se establecen con otras neuronas próximas de la corteza o lejanas, ya sea en el cerebro o fuera de él. Por el contrario las interneuronas actúan modulando el componente de excitación y por tanto son las principales moduladoras del sistema nervioso, además, al contrario que las anteriores, sus conexiones son sólo locales, es decir, sólo contactan con células relativamente próximas a ellas. Para que la corteza cerebral adulta y por extensión el sistema nervioso central funcionen con normalidad es requisito fundamental que el circuito compuesto por las conexiones entre las neuronas anteriormente citadas esté perfectamente ensamblado. La ruptura del equilibrio entre el componente excitador e inhibidor tiene consecuencias nefastas para el individuo manifestándose en multitud de síndromes neurológicos. Entre las causas del déficit de alguno de los componentes se encuentran los defectos en el desarrollo del circuito cerebral durante el periodo embrionario. El desarrollo del sitema nervioso central y, en concreto de la corteza cerebral, es un proceso de una gran complejidad. Uno de los procesos fundamentales para poder entender cómo se establecen los circuitos o conexiones en la corteza cerebral adulta corresponde a la migración neuronal. El proceso de migración celular es un paso fundamental y necesario para el establecimiento de las conexiones neuronales ya que permite que las neuronas, que en la mayoría de los casos son generadas en zonas alejadas de su ubicación final, adquieran su posición correcta dentro de la corteza cerebral. Por tanto, las neuronas de proyección así como las interneuronas corticales precisan realizar una migración como requisito previo al establecimiento funcional del circuito cortical. Además de las diferencias anteriormente descritas existentes en la corteza cerebral adulta, desde el punto de vista de los patrones de migración ambos tipos neuronales presentan importantes factores diferenciales. En primer lugar, las neuronas de proyección son generadas en la zona proliferativa de la misma corteza cerebral, aunque a una cierta distancia del su lugar de destino, por el contrario, las interneuronas corticales tienen su origen a una gran distancia de la corteza cerebral, en las zonas proliferativas de los ganglios basales, incluyendo fundamentalmente la eminencia ganglionar medial y la eminencia ganglionar caudal. Por tanto, además de la diferencia en las distancias a migrar, el patrón de migración es muy diferente, puesto que las neuronas de proyección solo precisan migrar radialmente, es decir perpendicular a las zonas proliferativas, mientras que las interneuronas corticales realizan una migración tangencial, paralela a las zonas proliferativas, finalizando con una migración radial para encontrar su posición definitiva. Además, la migración de las neuronas corticales se define como una migración de tipo gliofílico puesto que estas células migran íntimamente adheridas a los procesos apicales de la glia radial, unas células muy especializadas que además de actuar como andamiaje para la migración de las neuronas de proyección son también las células progenitoras de las mismas. Las interneuronas corticales, debido a su desplazamiento tangencial no pueden valerse de la guía física aportada por los procesos de la glía radial, ya que ésta se extiende exclusivamente desde la zona proliferativa hasta la membrana basal, íntimamente posicionada próxima a las meniges. Finalmente, la morfología de ambos tipos neuronales es muy diferente ya que las neuronas de proyección presentan un proceso guía único mientras que las interneuronas corticales poseen un proceso guía compuesto por múltiples ramificaciones. No sólo el proceso guía es diferente sino que en la parte posterior de las neuronas de proyección se dessarrolla, simultáneamente a la migración, el crecimiento del axón que navega en dirección contraria al desplazamiento de la célula para encontrar a su células diana. En las interneuronas corticales también hay un proceso en la parte posterior de la célula, sin embargo se trata de un proceso transitorio consecuencia del ciclo migratorio. Por tanto, parece claro que los mecanismos celulares que gobiernan las migraciones de ambos tipos celulares tienen importantes diferencias. La comprensión de los mecanismos reguladores de las migraciones corticales en ambos tipos celulares es un requisito indispensable para poder llegar a descifrar como se establecen las bases para el correcto funcionamiento de la corteza cerebral adulta. Objetivos de investigación: El proyecto de investigación que presento para la realización de tesis doctoral tiene como objetivo fundamental profundizar en los mecanismos celulares que gobiernan las migraciones de las neuronas corticales tratando de identificar los procesos intracelulares en los que se basan las principales diferencias entre los patrones de migracion radial y tangencial de las neuronas de proyección e interneurons, respectivamente. Metodología, hipótesis y plan de trabajo: Nuestra hipótesis de trabajo se basa en que las migraciones corticales presentan una serie de diferencias cuya regulación celular podría recaer en unos mecanismos intracelulares específicos. En concreto, trataremos de profundizar en dos aspectos característicos y diferenciales de las neuronal corticales: la dinámica del proceso guía y la adhesión celular durante la migración. Respecto al primer punto, mi objetivo será la caracterizacion de la dinámica del proceso guía de las interneuronas corticales durante su migración a través del subpalio y en la corteza cerebral. La peculiaridad de que el proceso guía esté compuesto de múltiples ramas, implica que el comportamiento celular frente a las señales extracelulares sea diferente frente a la bipolaridad de las neuronas de proyección en su migración radial. Abordaremos esta parte del proyecto mediante el estudio dinámico de la migración celular a través de video-microscopía confocal en tiempo real sobre cultivos organotípicos de rodajas coronales del telencéfalo de ratón en la segunda semana del desarrollo. Para poder marcar las interneuronas corticales realizaremos electroporaciones focales en la eminencia ganglionar medial mediante plásmidos de expresión codificantes para proteínas excitables fluorescentes. Estas técnicas, anteriormente empleadas en el laboratorio del Dr. Marín, me permitirán analizar el comportamiento de las interneuronas corticales en las diferentes etapas de la migración celular. En particular estudiaré la trascendencia de la presencia de múltiples ramas respecto a la habilidad de las interneuronas corticales para alcanzar su posición definitiva. Concretamente me interesa estudiar la relación entre esta característica peculiar de las interneuronas corticales frente a la complejidad de la guía extracelular descrita para las interneuronas respecto al escaso número de moléculas quimioatractivas reseñadas en el caso de las neuronas de proyección. Mi fin último será el de identificar proteínas intracelulares que participen en el establecimiento del carácter multipolar del proceso guía de las interneuronas corticales. Para ello emplearé diferentes inhibidores farmacológicos específicos para vías de señalización relacionadas con la regulación del citoesqueleto. Respecto al segundo punto, mi interés se centra en estudiar los mecanismos de adhesión que median la interacción específica de las neuronas de proyección con los procesos apicales de la glía radial. Actualmente en la bibliografía se han descrito dos tipos de proteínas de membrana que median esta interacción: integrinas y conexinas. El objetivo en esta parte del proyecto es el estudio de moléculas intracelulares de las neuronas de proyección implicadas en esta interacción con la glía radial, enfocándonos en el posible papel que en este sentido podría jugar la kinasa de adhesión focal (del inglés: FAK). Esta molécula intracelular no integrada en la membrana posee actividad kinasa y actúa en multitud de modelos como una proteína integradora de interacciones con otras vías de señalización. Su activación se produce a través de integrinas que a su vez fueron estimuladas por componentes de la matriz extracelular o neurotrofinas. Sus innumerables interacciones incluyen proteínas reguladoras del citoesqueleto, incluyendo microtúbulos y acto-miosina, adhesiones célula-célula, célula-matriz extracelular siendo uno de sus funciones más ampliamente conocidas la de regulación de las adhesiones focales. Por ello nuestra hipótesis de trabajo es que esta proteína es un candidato regulador de la interacción entre la neurona de proyección y la glia radial a través de la coordinación de las interacciones moleculares necesarias para establecerla. Para abordar el estudio, realizaré técnicas que me permitan analizar in vivo su participación en la migración radial de las neuronas de proyección. La técnica de electroporación in utero permite marcar las neuronas de proyección y analizar su migración durante el desarrollo. Emplearé esta aproximación combinada con técnicas genéticas mediante modelos animales y ARN de interferencia para bloquear la proteína y estudiar las posibles repercusiones en el patrón de migración. Este tipo de aproximaciones me permitirá también analizar con alta resolución, mediante el uso de microscopía confocal, la morfología de las neuronas de proyección en ausencia de FAK. Siendo este un punto importante a tener en cuenta ya que en la bibliografía hay reseñados varios ejemplos de cómo la interrupción experimental de la interacción neurona-glia implica la aparición de defectos morfológicos en las células. Finalmente evaluaremos el papel de la proteína respecto a las moléculas implicadas, anteriormente citadas, en la interacción glia-neurona mediante ensayos in vitro e in vivo de adhesión así como inmunohistoquímica para las mismas en presencia y ausencia de FAK. La identificación de las vías de señalización que se activarían a continuación de FAK será abordada mediante la realización de mutaciones puntuales en esta proteína. Las mutaciones irán dirigidas a modificar residuos de aminoácidos por otros que bloqueen interacciones con diferentes proteínas en determinadas vías de señalización.