Química supramolecular del estado liquidodisolventes nanoestructurados para la extraccion de micotoxinas en productor agroalimentarios

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª SERGIO GARCÍA FONSECA 1. Introducción o motivación de la Tesis El autoensamblaje de compuestos anfifílicos constituye una estrategia simple y eficaz para la síntesis de disolventes con características programadas para que cumplan funciones específicas. Las fases líquidas nanoestructuradas producidas, denominadas disolventes supramoleculares (SUPRASs), presentan propiedades extractivas excepcionales comparadas con las que presentan los disolventes moleculares e iónicos. El objeto de las investigaciones llevadas a cabo durante la realización de esta Tesis Doctoral ha sido la síntesis y/o aplicación de SUPRASs cuyas nanoestructuras y propiedades se han diseñado para que cumplan funciones específicas en dos áreas de interés; tratamiento de muestras para el análisis químico de micotoxinas en matrices agroalimentarias y purificación de aguas residuales industriales. Las micotoxinas son metabolitos tóxicos presentes en productos agrícolas utilizados como materias primas en la alimentación humana y animal o como residuos tóxicos en los productos de las explotaciones zootécnicas [1]. Estos metabolitos provocan importantes pérdidas económicas derivadas de sus efectos sobre la salud de las personas, la productividad de los animales y el comercio nacional e internacional. Diferentes instituciones y organismos nacionales e internacionales han fijado límites máximos permitidos y han desarrollado regulaciones al respecto [2,3]. El cumplimiento de la legislación vigente requiere disponer de métodos analíticos simples, rápidos y fiables para la detección y cuantificación de micotoxinas. En los métodos disponibles, la etapa de extracción y purificación de las muestras es la más lenta y compleja, y su eficacia depende tanto de la estructura de la micotoxina como de la matriz de la muestra. Se requiere por tanto el desarrollo de estrategias innovadoras que permitan eliminar las columnas de inmunoafinidad para la purificación de las muestras, tanto en métodos instrumentales como inmunoquímicos, reducir el consumo de disolvente orgánico, y extraer micotoxinas en un amplio intervalo de polaridad en una única etapa Por otro lado, la actividad industrial en los países desarrollados consume alrededor del 60% del gasto total del agua [4]. El tratamiento de aguas residuales industriales es esencial no sólo para evitar la contaminación de los recursos hídricos sino también para la reutilización de las mismas, aspecto fundamental para los países con déficit hídrico. Las estrategias más utilizadas en la actualidad, adsorbentes y membranas, no son viables en algunas aplicaciones debido al coste de adquisición u operación de las instalaciones y materiales requeridos, y/o eficacia o aplicación limitada. Se requiere por tanto el desarrollo de tecnologías limpias, económicamente viables, que tengan carácter multifuncional y por lo tanto permitan la extracción simultánea y eficaz de contaminantes químicos de diferente naturaleza. . 2. Contenido de la investigación En las investigaciones realizadas se han desarrollado tratamientos de muestras eficaces, genéricos, simples y de bajo coste para la determinación de micotoxinas en muestras agroalimentarias. Para ello se han utilizado disolventes supramoleculares con propiedades de acceso restringido (SUPRAS-RAM), sintetizados previamente por nuestro grupo de investigación a partir de ácidos carboxílicos en mezclas de tetrahidrofurano y agua [5, 6]. Estos disolventes tienen el potencial de extraer eficientemente los analitos y excluir las macromoléculas presentes en la matriz de la muestra mediante mecanismos químicos y físicos, así integrando las etapas de extracción y purificación Asimismo, las investigaciones realizadas incluyen la síntesis de nuevos disolventes supramoleculares a partir de moléculas anfifílicas naturales, estables cinéticamente, con baja capacidad de respuesta a las condiciones ambientales, y elevada eficacia de extracción para compuestos iónicos, polares e hidrófobos. Para ello, se han utilizado disoluciones coloidales vesiculares de ácidos carboxílicos en las cuales se induce la coacervación mediante la adición de sales de amonio cuaternario. Estos disolventes permiten el desarrollo de tecnologías no destructivas para la concentración de contaminantes orgánicos de diferente naturaleza química en aguas residuales industriales para su posterior reciclado o destrucción. En el ámbito del análisis químico de micotoxinas en productos agroalimentarios se han establecido cuatro nuevas metodologías. En la primera, se propone el uso de un SUPRAS-RAM, producido espontáneamente al disolver ácido decanoico (0.5%, w/v) en una mezcla de THF:vino (5:95, v/v), para la extracción de ocratoxina A (OTA) en vinos tinto, blanco y rosado, previo a su determinación mediante cromatografía de líquidos-detección fluorescente. El disolvente se forma in situ en el vino, se alcanza el equilibrio de extracción en 5 min y las recuperaciones para OTA oscilan entre el 85 y 100%, con factores de concentración comprendidos entre 105 y 125, utilizando 15 ml de muestra. Los límites de detección alcanzados (4.5-15 ng/L) son muy inferiores al valor límite establecido por la UE para OTA en vinos (2 µg/L). Las investigaciones desarrolladas incluyen el estudio de los diagramas de fases y caracterización del SUPRAS-RAM formado en el vino, la optimización del proceso de extracción, la validación in-house del método analítico y la aplicación a muestras reales (concentraciones de OTA halladas en el intervalo 15-21 ng/L). La principal ventaja de este método con respecto a los previamente descritos es la integración de las etapas de extracción y purificación de muestra en una única etapa y, por tanto, la no necesidad de utilizar una columna de inmunoafinidad para eliminar las interferencias de la matriz de la muestra. En la segunda metodología se propone un SUPRAS-RAM, sintetizado espontáneamente al disolver ácido decanoico (3%, w/v) en una mezcla de THF:agua (8:92, v/v), para la extracción de OTA en trigo previa a su determinación mediante cromatografía de líquidos-detección fluorescente. La síntesis del SUPRAS-RAM se realiza en presencia de la matriz de la muestra. La extracción de OTA es prácticamente cuantitativa (recuperaciones en el intervalo 84-95%), el equilibrio de extracción se alcanza en 15 min y el extracto se analiza directamente. La extracción de la muestra (300 mg) requiere el uso de 350 µL de SUPRAS-RAM. El límite de cuantificación (1.5 µg/kg) es inferior al valor límite establecido por la UE para OTA en cereales (5 µg/kg). Las investigaciones desarrolladas incluyen el estudio del diagrama de fases y caracterización del SUPRAS-RAM producido en presencia de la matriz del trigo, estudios de representatividad de la muestra y la influencia del tamaño de partícula en la distribución homogénea o heterogénea de la OTA en la matriz, la optimización de las variables que influyen en el proceso de extracción, la validación in-house y con el uso de materiales certificados de referencia del método analítico desarrollado y el análisis de muestras de trigo. La principal ventaja del método propuesto con respecto a los previamente descritos es la reducción del consumo de disolvente orgánico (generalmente se requiere de 50-250 ml) y la integración de las etapas de extracción y purificación en una simple etapa. En la tercera metodología se propone el uso de un SUPRAS-RAM, sintetizado espontáneamente al disolver ácido oleico en una mezcla THF:10 mM HCl (67:33, v/v), para la extracción de toxinas Fusarium (Zearalenona, Desoxinivalenol, Fumonisina B1 y Fumonisina B2) en cereales (trigo y maíz) previo a su determinación mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem. La síntesis del SUPRAS-RAM se realiza en la disolución indicada y una vez formado, 600 µl se adicionan a 300 mg de cereal. El equilibrio de extracción se alcanza en 15 min, los porcentajes de recuperación oscilan entre el 87 y 105% y los límites de detección (8-15 µg/kg) son muy inferiores a los límites máximos permitidos por la UE. Las investigaciones realizadas incluyen el estudio de las propiedades RAM del SUPRAS sintetizado, la optimización del proceso de extracción, la validación in-house del método analítico y la aplicación al análisis de muestras de cereales. Las ventajas más importantes de este método son: su elevada eficiencia de extracción para analitos que varían en un amplio intervalo de polaridad (log Kow desde -0.7 hasta 3.6), la reducción del consumo de disolvente y la eliminación de la etapa de purificación de la muestra. En la cuarta metodología se propone el uso de SUPRAS-RAM para la simultánea extracción de micotoxinas y purificación de la muestra, previo a su cuantificación mediante métodos inmunoquímicos, en aquellas aplicaciones en las que se recomienda el uso de columnas de inmunoafinidad para la eliminación de interferencias. Para ello se usa un SUPRAS-RAM sintetizado espontáneamente al disolver ácido tetradecanoico en mezclas de THF:agua, con 20% de THF y diferentes condiciones de acidez. El disolvente se utiliza para la extracción de OTA en vinos (tinto, blanco y dulce) y especias (pimentón, nuez moscada y pimienta negra) y aflatoxina B1 en cereales. Una vez realizado el proceso de extracción se elimina el THF, lo que provoca la precipitación del ácido tetradecanoico. Las micotoxinas se disuelven en una disolución reguladora de fosfato (pH 8) y se determinan mediante la técnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Las investigaciones realizadas incluyen la selección del tensioactivo, la optimización del proceso de proceso de extracción y reextracción de las micotoxinas, la validación del método utilizando materiales certificados de referencia y la aplicación al análisis de muestras reales. La ventaja del método, especialmente para muestras sólidas, es la integración de la etapa de extracción y purificación en una única etapa, eliminando la necesidad de usar columnas de inmunoafinidad. En relación al uso de SUPRAS para la purificación de aguas residuales, se describe la síntesis y caracterización de nuevos SUPRAS, se evalúan sus propiedades extractantes para compuestos orgánicos iónicos, polares e hidrófobos y se discuten sus prestaciones para su aplicación en el tratamiento de aguas residuales. Las investigaciones realizadas incluyen el estudio del diagrama de fases, la determinación de las propiedades físico-químicas de los SUPRASs sintetizados y la función de la longitud de la cadena hidrocarbonada de las sales de tetraalquilamonio en las características de los mismos, el estudio de la composición mediante cromatografía de líquidos y valoración de Karl Fisher y la caracterización de las nanoestructuras que los conforman mediante microscopía electrónica de transmisión y barrido. Asimismo se estudia la eficiencia de extracción para PAHs y colorantes catiónicos y aniónicos y se sugieren diferentes mecanismos de extracción de acuerdo a la polaridad y carga de los contaminantes. 3. Conclusión Las investigaciones desarrolladas han demostrado la capacidad de los disolventes supramoleculares para el desarrollo de metodologías innovadoras en las dos áreas de estudio seleccionadas: tratamiento de muestras para el análisis químico de micotoxinas en matrices agroalimentarias y purificación de aguas residuales industriales. Las conclusiones más relevantes relacionadas con el tratamiento de muestras para el análisis químico de micotoxinas en matrices agroalimentarias se enumeran a continuación. 1. Los SUPRAS formados a partir de ácido carboxílicos en mezclas de THF y agua pueden excluir macromoléculas mediante mecanismos químicos y físicos y por lo tanto tienen propiedades de acceso restringido (RAM). Esto ha permitido la integración de la etapa de extracción de micotoxinas y eliminación de los macrocomponentes de las matrices agroalimentarias y, como resultado, el desarrollo de metodologías simples y rápidas para el tratamiento de muestras en el análisis químico de micotoxinas. 2. Los SUPRAS-RAM investigados, formados a partir de ácidos decanoico, tetradecanoico y oleico, tienen la capacidad de extraer eficazmente micotoxinas en un amplio intervalo de polaridad (log P -0.5-4.6) tanto de muestras líquidas como sólidas. Los porcentajes de recuperación obtenidos en nuestros estudios se encuentran en el intervalo 84-105%. Esta capacidad es consecuencia de la elevada concentración de compuesto anfifílico en los SUPRAS investigados (0.2-0.7 mg/μL), los diferentes microambientes de polaridad presentes en los agregados hexagonales inversos, y los mecanismos mixtos de interacción ofrecidos por el SUPRAS para solubilización de los compuestos (interacciones de van der Waals, puentes de hidrógeno e interacciones polares). 3. La combinación de la elevada eficacia de extracción y propiedades RAM de los SUPRAS ha permitido el desarrollo de 4 metodologías para la determinación de ocratoxina en vinos y cereales combinando SUPRAS-RAM con cromatografía de líquidos y detección fluorescente, zearalenona, desoxinivalenol, fumonisina B1 y fumonisina B2 en cereales mediante la combinación de SUPRAS-RAM con cromatografía de líquidos y espectrometría de masas y ocratoxina A en vinos y especias y aflatoxina B1 en cereales combinando SUPRAS-RAM, previa eliminación del ácido carboxílico, con métodos inmunoquímicos. 4. Todas las metodologías desarrolladas cumplen con los criterios de funcionamiento requeridos, en términos de sensibilidad, selectividad, precisión, etc, para la determinación de las micotoxinas para las que se han validado, y por tanto pueden utilizarse para el control de las mismas en productos agroalimentarios. Dadas las características de estas metodologías, los SUPRAS-RAM son idóneos para el desarrollo de procedimientos generalizados de tratamiento de muestras. 5. Los procedimientos de extracción desarrollados para las diferentes muestras analizadas son rápidos (5-15 min) y utilizan bajos volúmenes de disolvente. Ello se debe a que los SUPRASs están constituidos por microgotas y por lo tanto, durante la extracción se forma una microemulsión que facilita la transferencia de fase de los solutos. Son por tanto idóneos para reducir los tiempos de análisis y costes en el control de calidad de productos agroalimentarios. 6. Todos los procedimientos de extracción pueden ser implementados utilizando material comúnmente presente en cualquier laboratorio de análisis químico (agitadores vórtex, centrífugas, etc.) y los SUPRAS se obtienen espontáneamente a través de procedimientos sintéticos muy simples. Las conclusiones más relevantes relacionadas con la purificación de aguas residuales industriales se enumeran a continuación. 1. Se ha demostrado el potencial de los SUPRAS vesiculares formados a partir de mezclas de ácidos carboxílicos y carboxilatos en presencia de sales de tetraalquil amonio para el desarrollo de tecnologías innovadoras no destructivas para la concentración de contaminantes orgánicos, de diferente naturaleza química, en aguas residuales industriales, como una etapa previa a su posterior reciclado o destrucción. 2. Las propiedades físico-química de los SUPRAS (miscibilidad con agua, densidad, viscosidad, tensión superficial), estabilidad cinética, capacidad de respuesta a las condiciones ambientales, capacidad de extracción de compuestos iónicos, polares e hidrófobos, etc puede modificarse variando la longitud de la cadena hidrocarbonada de la sal de amonio utilizada como agente coacervante. 3. Los SUPRAS están constituidos por agregados vesiculares unidos por sales de tetraalquilamonio a través de las interacciones hidrófobas de las cadenas alquilo. 4. Los SUPRAS vesiculares presentan diferentes regiones para la solubilización de solutos y distintos tipos de interacciones (van der Waals, puentes de hidrógeno, polares, iónicas y π-catión). Las regiones más probables para la solubilización de los diferentes tipos de contaminantes son: (A) las sustancias hidrófobas en las cadenas hidrocarbonadas del ácido carboxílico; (B) los compuestos polares mediante interacción con los grupos polares del ácido carboxílico; (C) los compuestos orgánicos catiónicos mediante interacción con el grupo carboxilato, y (D) los compuestos orgánicos aniónicos mediante interacción con el ion amonio cuaternario que enlazan las vesículas. 5. Los SUPRAS vesiculares son extractantes idóneos para la purificación de aguas residuales que contienen compuestos químicos en un amplio intervalo de polaridad, pueden considerarse por tanto extractantes multifuncionales. n)