Aportaciones moleculares al diagnostico de las multiparasitaciones por geohelmintos

Resumen

El diagnóstico de las geohelmintiasis por Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y Strongyloides stercoralis es actualmente uno de los grandes retos diagnósticos en parasitología, siendo además definidas por la Organización Mundial de la Salud como las enfermedades más prevalentes dentro de las Neglected Tropical Diseases. Actualmente el diagnóstico basado en técnicas parasitológicas convencionales para las uncinariasis, ascariasis y tricuriasis hacen necesario la puesta a punto de técnicas diagnósticas más sensibles y específicas para su correcta detección y para una mejor evaluación de los programas de control con administración masiva de fármacos establecidos por la OMS. En el caso de la estrongiloidiasis, debido a la forma de la presentación de la enfermedad (crónica con un elevado porcentaje de asintomáticos), a la carencia de una técnica de referencia ¿gold standard¿ y a la frecuencia de su aparición en nuestro país como una de las primeras causas de eosinofilia no filiada en población inmigrante y viajeros a zona endémica, este reto es aún mayor. Los objetivos en los cuales se encuentra enmarcada esta tesis doctoral responden de una forma novedosa al problema del diagnóstico de estas patologías con que se encuentra el personal sanitario del Sistema Nacional de Salud y los investigadores cuya línea de trabajo está dirigida al estudio de estas parasitosis. La mejora de las técnicas de diagnóstico serológico disponibles consistió en el desarrollo de un ensayo ELISA para la detección de subclases de isotipos de inmunoglobulinas G1 y G4 anti-Strongyloides spp. y un ensayo de Western Blot para identificar posibles proteínas de Strongyloides spp. con potencial interés diagnóstico. El método ELISA para la detección de IgG1 e IgG4 mejoró la interpretación de los resultados que por ELISA IgG-IVD rinden valores de índice entre 1 y 2, y el reconocimiento por Western Blot del complejo proteico de 27 a 41 KDa es confirmatorio por su alto valor diagnóstico. Ambas técnicas fueron evaluadas en muestras clínicas de sueros de pacientes, inmigrantes o viajeros, con sospecha de padecer estrongiloidiasis y la técnica ELISA se aplicó también en muestras de suero de población general en zona endémica (Etiopía).Nuestros resultados sugieren que la subclase G1 perdura más a lo largo del tiempo y la presencia de la subclase G4 puede estar relacionada con ciclos de autoinfección, existiendo patrones definidos en su relación con la IgE. Además, el elevado porcentaje de resultados positivos obtenidos en pacientes viajeros apoya la necesidad de realizar un cribado sistemático. En referencia a las técnicas moleculares se optimizó una multiplex-PCR en tiempo real para la detección de los diferentes geohelmintos. La optimización de un protocolo de extracción de ADN para las muestras concentradas de heces de pacientes con sospecha de geohelmintiasis ha sido un punto clave para conseguir una mayor eficacia en la rotura de los huevos de Ascaris spp. y Trichuris spp. y en consecuencia un mayor rendimiento en el aislamiento de ADN de dichos estadios parasitarios de compleja estructura. La aplicación de la técnica PCR-rt-múltiplex por primera vez en nuestro país en muestras de heces de inmigrantes y viajeros y en poblaciones de zonas endémicas de África (Mozambique y Angola) ha permitido el diagnóstico de geohelmintiasis únicas y de multi-infecciones por dos o más geohelmintos. Strongyloides spp. ha sido el geohelminto mayoritariamente detectado en las poblaciones inmigrante y viajera de nuestro país e infantil de Angola analizadas, y tras las uncinarias en la población general de Mozambique, hecho que confirma la sospecha de subestimación de esta parasitosis y la necesidad de establecer programas de control específicos para ella. Estos resultados son relevantes para el avance en el diagnóstico de las geohelmintiasis, permitiendo un mejor diseño y evaluación de las medidas de control para su erradicación.