Métodos rápidos basados en espectrometría de masas para la detección y cuantificación de biomarcadores

Resumen

El objetivo de esta tesis es el desarrollo y validación de metodologías analíticas para el análisis de biomarcadores de enfermedades y de exposición. Dentro de lo posible, se trata de reducir el tiempo de análisis y minimizar la manipulación de muestra. Esta tesis se presenta en la modalidad por compendio de publicaciones, y los diferentes artículos publicados a partir del trabajo realizado se han dividido en tres capítulos generales en función de los compuestos estudiados: 1.-Determinación de compuestos orgánicos volátiles en muestras de orina: en este capítulo se determinan 9 cetonas y acetato de etilo en muestras de orina de pacientes con cáncer de pulmón e individuos sanos mediante una metodología basada en generación de espacio de cabeza-inyección a temperatura programada-cromatografía de gases-espectrometría de masas (HS-PTV-GC-MS). Estos compuestos se han cuantificado en las muestras analizadas y la diferencia en las concentraciones en los grupos estudiados ha permitido proponer tres de ellos (acetato de etilo, 3-heptanona y 3-octanona) como potenciales biomarcadores de la enfermedad, al ser su concentración siempre mayor en sujetos con la enfermedad. 2.-Determinación de hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAHs) en muestras biológicas. En este capítulo se han puesto a punto metodologías no separativas y separativas. La metodología no separativa, basada en extracción líquido-líquido (LLE)-PTV-MS, se ha aplicado a la determinación de PAHs en muestras de orina. Mediante técnicas quimiométricas ha sido posible cuantificar los compuestos de estudio en muestras de orina dopadas (regresión por mínimos cuadrados parciales, PLS) y realizar un estudio cualitativo para explorar (análisis de componentes principales, PCA) y clasificar (modelado independiente de clases (SIMCA), análisis discriminante lineal (LDA), análisis discriminante con mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y técnica de las muestras apoyadas en la frontera (SVM)) las muestras analizadas de acuerdo a la presencia o ausencia de PAHs. Además, en este capítulo se han desarrollado y comparado dos metodologías separativas (PTV-GC-MS) para la determinación de PAHs en muestras de saliva que difieren en la técnica de extracción. La primera de ellas, basada en LLE, se ha utilizado para determinar PAHs en salivas de bomberos y de voluntarios no expuestos, observándose una disminución en la concentración desde la extinción de un fuego a lo largo del tiempo gracias a un análisis mediante PCA y a la cuantificación de los analitos mediante calibración externa en acetato de etilo. En la segunda metodología, basada en microextracción de sorbentes empaquetados (MEPS) se consiguen resultados similares en cuanto a sensibilidad y es posible automatizar todo el proceso de análisis. Sin embargo, la cuantificación de PAHs requiere un proceso más complejo (adición estándar) debido a la existencia de efecto matriz. Esta metodología se utilizó para determinar PAHs en salivas de voluntarios no fumadores y uno de los compuestos de estudio se detectó y cuantificó en una de las salivas analizadas. Por último, en este capítulo se incluye un artículo de revisión que recoge los estudios bibliográficos enfocados a la determinación de PAHs en matrices biológicas humanas. 3.- El último capítulo está enfocado a la determinación de aminoácidos en muestras de saliva mediante una metodología rápida no separativa basada en derivatización (DER)-LLE-PTV-MS. Para cuantificar los analitos se ha utilizado la técnica PLS. Los resultados han sido satisfactorios al compararlos con una metodología separativa (DER-LLE-PTV-GC-MS) utilizada con fines de confirmación. Teniendo en cuenta que los niveles de estos compuestos se modifican en presencia de ciertas enfermedades, en este trabajo se propone la siguiente estrategia: uso de una metodología rápida no separativa para el análisis de un gran número de muestras (screening), y confirmación de resultados en muestras con concentraciones anormales de los compuestos de estudio mediante la metodología separativa, que a pesar de ser más sensible, requiere mayor tiempo de análisis y de recuperación de las condiciones de la configuración instrumental utilizada para el siguiente análisis.