Determinación de xenobióticos y concentración de sustancias endógenas en matrices biológicas

Résumé

1. introducción o motivación de la tesis Esta Tesis Doctoral ha tenido como objeto de estudio el desarrollo y aplicación de nuevos y eficientes procesos de extracción de xenobioticos y substancias endógenas en matrices biológicas complejas, basados en química verde [1, 2]. Los métodos que se han desarrollado han pretendido extender la utilización tanto de la precipitación de proteínas séricas con acetonitrilo (PPT) [3] como de los disolventes supramoleculares (SUPRAS) [4, 5] a aplicaciones veterinarias, forenses, clínicas y de seguridad y calidad alimentaria. 2. contenido de la investigación La Memoria de esta Tesis Doctoral se ha estructurado en dos bloques, precedidos de una Introducción en la que se describen las nuevas estrategias de la Química Bioanalítica para la reducción del consumo de disolventes orgánicos en procesos de extracción analítica de substancias endógenas y xenobióticos en matrices biológicas. Asimismo, se ilustran los aspectos teóricos y prácticos de las dos metodologías extractivas aplicadas en esta Tesis (precipitación de proteínas con acetonitrilo y SUPRAS). Los contenidos de los dos bloques se especifican a continuación: Bloque A: Determinación de antioxidantes endógenos, con alta sensibilidad a la luz y al aire, a través una metodología basada en tratamiento de muestras con precipitación de proteínas y cromatografía de líquidos con detección UV. En este bloque se describe una metodología analítica para la determinación de β-caroteno, retinol y α-tocoferol en suero de burros y caballos y cuatro de sus diversas aplicaciones en clínica veterinaria (capítulos 1, 2, 3, 4). Este tratamiento de muestra consistió en la adición de 600 microlitros de acetonitrilo a 300 microlitros de suero, lo que resultó en la precipitación de las proteínas. El extracto así obtenido se secó y redisolvió en 150 microlitros de fase móvil para su posterior análisis mediante cromatografía de líquidos con detección UV. El método fue validado cumpliendo todos los requisitos internacionales requeridos. Bloque B: Plataformas analíticas independientes de la matriz y basadas en SUPRAS para la cuantificación de multicomponentes en multimatrices mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem. El objeto de las investigaciones presentadas en este bloque ha sido el desarrollo de metodologías innovadoras, basadas en SUPRAS, para la determinación de anfetaminas (capítulo 5), aminoácidos y oligopéptidos (capítulo 6) y antihelmínticos (capítulo 7) en muy diversas matrices biológicas. Como tratamiento de muestra se utilizaron dos SUPRAS diferentes: uno obtenido mediante la coacervación de disoluciones coloidales de micelas inversas de hexanol (capítulos 5 y 7), y un segundo formado por coacervación de ácido heptafluorobutírico (HFBA) en disoluciones acuosas acidas (capítulo 6). Los dos SUPRAS estudiados presentaron propiedades de acceso restringido. En ambos casos se desarrollaron procedimientos generalizados que demostraron ser independientes de la matriz, y capaces de simplificar en una sola etapa todo el proceso de purificación y extracción (<35 minutos). Las matrices biológicas estudiadas fueron orina, suero, saliva, sudor, leche materna, pelo, uñas y leche de vaca para consumo humano. Todos los extractos obtenidos fueron analizados mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem. Los tres métodos desarrollados fueron totalmente validados según la legislación internacional pertinente. 3. Conclusión Las principales conclusiones que pueden extraerse de esta tesis son: Bloque A: Determinación de antioxidantes endógenos, con alta sensibilidad a la luz y al aire, a través una metodología basada en tratamiento de muestras con precipitación de proteínas y cromatografía de líquidos con detección UV. • La metodología analítica basada en el tratamiento de muestra mediante la precipitación de proteínas (PPT) con acetonitrilo y posterior análisis mediante cromatografía de líquidos con detección UV ha demostrado una excelente capacidad para la determinación de antioxidantes endógenos de elevado coeficiente de partición (XLogP3 13.5, 10.7 and 5.7 para β-caroteno, α-tocoferol y retinol, respectivamente). Además, se han obtenido recuperaciones cuantitativas (70-120%) y óptimos límites de detección (0.036 µg mL-1), gracias al factor de pre-concentración alcanzado (x2). • PPT ha demostrado ser una metodología verde, adecuada para el tratamiento de muestras de suero. Además, la inducción de precipitación de proteínas (>90%) mediante una relación muestra/ACN de 1:2, la posterior evaporación de la disolución resultante hasta sequedad, y la redisolución del extracto en fase móvil (relación muestra/solución de reconstitución de 2:1), han resultado en la eliminación del efecto matriz y garantizado el empleo de poco disolvente, el aumento del factor de pre-concentración y una óptima compatibilidad con el sistema UV. • El método analítico desarrollado y empleado en los capítulos 1-4 ha sido totalmente validado siguiendo las líneas guías internacionales, obteniéndose valores óptimos de linealidad, sensibilidad, precisión y exactitud. Bloque B: Plataformas analíticas independientes de la matriz y basadas en SUPRAS para la cuantificación de multicomponentes en multimatrices mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem. • La extracción mediante SUPRAS basados en hexanol ha permitido obtener extracciones eficientes para analitos (anfetaminas y antihelmínticos) con características químico-físicas muy diferentes, gracias a la capacidad del SUPRAS de disolver solutos mediante un mecanismo mixto (interacciones de van der Waals, puentes de hidrógeno, interacciones polares, e interacciones π-catión). Además, estos SUPRAS han demostrado tener una aplicabilidad excelente (con eliminación de los interferentes endógenos) para numerosas matrices biológicas (suero, orina, saliva, sudor, leche materna, leche de vaca, pelo y uñas). Estos SUPRAS han demostrado ser disolventes “à la carte” que se pueden sintetizar de forma totalmente espontánea y directa en matrices liquidas. Además, tienen capacidad para actuar como materiales con propiedades de acceso restringido (RAM), o como agentes volátiles con propiedades de acceso restringido (RAM-VOL-SUPRAS) si se añade al proceso una etapa de evaporación para la eliminación de los fosfolípidos. Gracias a esta propiedad, las moléculas de bajo peso molecular se solubilizan en el SUPRAS, mientras que interferentes como proteínas o polisacáridos están excluidos física (precipitación por THF) y/o químicamente (fenómenos de exclusión). Estos SUPRAS basados en hexanol han permitido la determinación de 5 anfetaminas en 7 matrices biológicas diferentes y 8 benzimidazoles antihelmínticos en leche de vaca mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Los límites de detección encontrados están, para todos los casos, por debajo de los límites legislados y pertinentes para cada analito. • Se ha propuesto en esta Tesis, por primera vez, un SUPRAS basado en ácido heptafluorobutírico (HFBA) como disolvente alternativo para la extracción de analitos muy polares (aminoácidos y oligopéptidos), cuya extracción en muestras biológicas se considera una tarea muy compleja. Esta interesante capacidad de extracción está relacionada con la “polaridad hidrofóbica” que presentan los compuestos perfluorados. Así, este SUPRAS ha sido capaz extraer de con elevado rendimiento (recuperaciones>80%) 20 aminoácidos y 9 oligopéptidos con valores de D de hasta -3. Adicionalmente, se ha llevado a cabo también la determinación del oligopéptido Opiorfina en saliva, por inyección directa en LC-MS/MS del extracto del SUPRAS basado en HFBA. • Las metodologías analíticas de extracción/limpieza basadas en SUPRAS constan de una única etapa que permite tratar muestras de forma simple, en muy poco tiempo, y empleando poca cantidad de muestra y de disolventes orgánicos (tiempo 15-35 min, muestra ≤ 1 mL, disolvente orgánico <2 mL). Por estos motivos, estas metodologías basadas en SUPRAS pueden encuadrarse dentro de la química analítica verde. • Las tres metodologías basadas en SUPRAS han sido totalmente validadas siguiendo los parámetros requeridos por las respectivas guías internacionales, obteniéndose valores óptimos de linealidad, sensibilidad, selectividad, precisión y exactitud. 4. Bibliografía [1] Z. Niu, W. Zhang, C. Yu, J. Zhang, Y. Wen, TrAC. Trends Anal. Chem., 102 (2018) 123–146. [2] J. Namieśnik, Crit. Rev. Anal. Chem., 30 (2000) 221–269. [3] J.H. Oh, Y.J. Lee, Phytochem. Anal., 25 (2014) 314–330. [4] C. Caballo, M.D. Sicilia, S. Rubio, Supramolecular Solvents for Green Chemistry. In: F. Pena-Pereira, M. Tobiszewsky (eds) The Application of Green Solvents in Separation Processes. Elsevier, (2017). [5] A. Ballesteros-Gómez, M.D. Sicilia, S. Rubio, Anal. Chim. Acta, 677 (2010) 108–130.