New insights into plasma cell differentiation and unfolded protein responseRole of DEPTOR and IRE1

Resumen

Hipótesis: La transición de células B (CB) a células plasmáticas (CP) implica profundas modificaciones transcripcionales que dan como resultado el fenotipo de CP, caracterizado por una capacidad de supervivencia a largo plazo, y la producción y secreción de anticuerpos. Los defectos en el desarrollo de las CP pueden provocar enfermedades graves. De hecho, la interrupción del proceso de diferenciación de la CB, como consecuencia de mutaciones en factores clave en su maduración, se ha asociado con su transformación maligna. Aunque el conocimiento de las bases moleculares que regulan la formación de la CP ha avanzado en los últimos años, muchos de los mecanismos implicados en el mantenimiento de las CP de larga duración, que son las células que se acumulan anormalmente en la medula ósea de los pacientes con mieloma múltiple (MM), son aún desconocidos. Profundizar en el conocimiento de los factores implicados en la maduración de las CP podría ayudarnos a comprender la patogenia del MM y, por tanto, brindar nuevas perspectivas para el desarrollo de estrategias terapéuticas más efectivas que ayuden a bloquear la actividad tumoral de las CP en el MM. En un análisis previo de expresión génica mediante microarrays, habíamos observado que el ARNm que codifica DEPTOR e IRE1 estaba sobreexpresado en las CP normales y en las células del MM en comparación con los linfocitos B normales. Por este motivo, planteamos la hipótesis de que la expresión variable de las proteínas DEPTOR e IRE1 podría contribuir a inducir diferentes estados de maduración de las células del MM. DEPTOR es un inhibidor de mTOR que está sobreexpresado en los MM con translocaciones de CCND1 o CCND3, o MAF o MAFB. En estas células, se observó que se necesitaba una alta expresión de DEPTOR para mantener la activación de PI3K y AKT, y que la reducción de los niveles de DEPTOR conducía a la apoptosis. Sin embargo, no se ha descrito el posible papel de DEPTOR en la maduración de la CP. Se ha demostrado que el sensor de estrés en el retículo endoplásmico, IRE1, es necesario durante la diferenciación temprana y tardía de las CB. Por un lado, es fundamental en la etapa de células pro-B para la recombinación de los segmentos V(D)J de los genes de las inmunoglobulinas, y por otro lado, se ha demostrado que IRE1 es indispensable para la diferenciación terminal de la CB en CP a través de la activación de XBP1. En los últimos años, se ha descubierto que numerosos microRNAs participan en la maduración de las CB. Este hecho nos llevó a pensar que la expresión tanto de DEPTOR como de IRE1 también podría estar regulada a nivel postranscripcional por microRNAs. Además de participar en la maduración de la CP, también se ha demostrado que IRE1 es capaz de degradar algunos ARNm de una manera diferente a como lo hace con XBP1. Este mecanismo conocido como “regulated IRE1-dependent decay (RIDD)” puede depender de la naturaleza de los estímulos de estrés y del tejido donde se produzca. Diferentes investigaciones sugieren que aún quedan muchas dianas de RIDD por identificar. En las células de mieloma, la única diana de RIDD que se ha identificado es el ARNm de BLOC1S1. Nuestra hipótesis plantea que podrían existir muchas otras dianas RIDD en el MM y que algunas de ellas podrían regular la supervivencia o proliferación de las células del MM. Resultados Capítulo I: En este capítulo, exploramos el papel de DEPTOR, un inhibidor de mTOR, en la diferenciación terminal de las células del mieloma múltiple (MM) y su repercusión potencial en la supervivencia de los pacientes. El silenciamiento de DEPTOR en las líneas celulares H929 y MM1S indujo la desdiferenciación de las células mielomatosas, como lo demostró el aumento de la expresión de los factores de transcripción PAX5 y BCL6, el descenso de la expresión del factor de transcripción IRF4, y la reducción en el tamaño celular y del retículo endoplásmico. Este efecto fue independiente de la señalización de mTOR, ya que los sustratos de mTOR no se vieron afectados por el descenso de DEPTOR. Además, se investigó la posibilidad de que DEPTOR estuviera desregulado en el MM por la acción de los miRNAs. Así, se observó que la expresión ectópica de los miR-135b y miR-642a en líneas celulares de MM disminuyó sustancialmente los niveles de la proteína DEPTOR y provocó la desdiferenciación de las células tumorales del MM. La cuantificación de la proteína DEPTOR en pacientes con MM puso de manifiesto que sus altos niveles de expresión se asociaban con una supervivencia libre de progresión más prolongada. Nuestros resultados demuestran por primera vez que la expresión de DEPTOR es requerida para mantener la diferenciación de las células del MM y que un alto nivel de su expresión se asocia con una supervivencia más prolongada. Capítulo II: La maduración de las células B conlleva una serie de procesos estrechamente controlados por determinadas vías de señalización, factores de transcripción y miRNAs. En este capítulo, investigamos el papel de IRE1 en la diferenciación terminal de las células del MM. El silenciamiento de IRE1 en las líneas celulares H929 y MM1S provocó la desdiferenciación de las células mielomatosas, como lo evidenció el aumento de expresión de PAX5 y BCL6. Además, los ensayos de luciferasa y de ganancia de función demostraron que los miR-124 y miR-506 regulaban la expresión de IRE1 en el MM. La expresión ectópica de miR-124 y miR506 en las líneas celulares de mieloma disminuyó sustancialmente los niveles de proteína IRE1 y causó la desdiferenciación de las células de mieloma, como lo demostró la disminución de la concentración de IRF4 e Igƙ, y la reducción en el tamaño celular y del retículo endoplásmico. Nuestros resultados muestran que la expresión de IRE1 consigue mantener la diferenciación de las células tumorales del MM. Capítulo III: IRE1 es un sensor de la respuesta a las proteínas mal plegadas con actividad de cinasa y endonucleasa. Desempeña un papel central en la respuesta al estrés en el retículo endoplásmico (RE) a través del “splicing” no convencional del ARNm de XBP1 y del proceso “regulated IRE1-dependent decay (RIDD)”. Se sabe que las células tumorales del MM poseen un nivel elevado de estrés basal en el RE, sin embargo, la actividad de RIDD apenas se ha estudiado en esta enfermedad. Para investigar nuevas dianas de RIDD de posible relevancia para la supervivencia y/o proliferación de las células del MM, se combinaron ensayos de escisión in vitro con técnicas de secuenciación de ARN. El análisis bioinformático reveló cientos de posibles sustratos de IRE1, de los cuales 32 fueron elegidos para la validación. Analizando la estructura secundaria de los sustratos de IRE1, se observó que las secuencias consenso de los mRNA de IRF4, PRDM1, IKZF1, KLF13, NOTCH1, ATR, DICER, RICTOR, CDK12, FAM168B y CENPF estaban acompañadas por una estructura “stem loop” esencial para la escisión mediada por IRE1. Además los niveles de ARNm y proteínas correspondientes a estas dianas se atenuaron de manera dependiente de IRE1 mediante el tratamiento con agentes inductores del estrés en el RE. Nuestros resultados demuestran por primera vez que IRE1 es un regulador clave de varias proteínas implicadas en la supervivencia y proliferación del MM.