Aplicación de células madre derivadas de tejido adiposo en le reparación de esfínteres anales en un modelo de lesión esfinteriana. Estudio experimental en ratas

Resumen

Introducción: La incontinencia fecal es una patología de gran prevalencia, que genera una importante repercusión en los pacientes (sobre todo en su calidad de vida y en la esfera psicológica) y que asocia un gasto económico muy relevante para el sistema y las personas. La lesión esfinteriana es su causa más frecuente y su tratamiento de elección, ante lesiones mayores, es la reparación quirúrgica, si bien sus resultados distan de ser ideales, sobre todo a largo plazo. Estudios experimentales y clínicos han demostrado que las células troncales, y en concreto las derivadas de tejido adiposo (ASCs, Adipose-derived Stem Cells), tienen un papel importante en los procesos de reparación in vitro e in vivo y por ello se han empleado en múltiples modelos y enfermedades con resultados alentadores. Parece que las ASCs actúan esencialmente mediante sus propiedades inmunomoduladoras (importantes sobre todo en procesos inflamatorios crónicos y en reacciones autoinmunes), proangiogénicas y de diferenciación hacia otros tipos celulares, aunque los mecanismos exactos de actuación no se conocen con exactitud. Hipótesis y objetivos: Nos planteamos si las ASCs autólogas podrían mejorar los procesos de cicatrización tras las reparaciones esfinterianas y de esta manera mejorar sus resultados. Por tanto el objetivo fundamental es evaluar su potencial eficacia y su seguridad en esta aplicación en un modelo murino. Material y métodos: Se emplearon un total de 155 ratas hembras, 34 (20 Wistar y 14 BDIX) para estudios preliminares de caracterización anatómica y puesta a punto del modelo lesional y de los modelos anestésico y de valoración funcional y 121 BDIX para los estudios de terapia celular. Los 121 animales de los estudios de terapia celular se repartieron en los siguientes grupos: 1 (lesión esfinteriana sin reparación), 2 (lesión y reparación con suturas recubiertas de 1.5x106 ASCs –SRCs-), 3 (lesión e inyección perilesional de 106 ASCs), 4 (lesión, reparación e inyección de ASCs), 5 (lesión y reparación con sutura convencional) y 6 (sin lesión). 60 animales se emplearon para un seguimiento a corto plazo (con sacrificios a 1, 4 y 7 días) y en ellos se realizaron las siguientes valoraciones: conducta defecatoria, clínica (local y general), morfología esfinteriana (macroscópica, histológica e inmunofluorescencia) y estudio de eventos adversos. Los restantes 61 animales se emplearon para estudios funcionales (preoperatorio, del postoperatorio inmediato y a 4, 7, 15 y 30 días de evolución) y se sacrificaron a los 30 días valorándose en el seguimiento los aspectos ya señalados salvo la conducta defecatoria. Todo ello implica previamente el aislamiento de células ASCs de la rata BDIX y producir y realizar controles de calidad para las suturas recubiertas y para los productos usados en la inyección celular. Resultados: En primer lugar se caracterizó la anatomía de la región esfinteriana anal murina. Posteriormente se confirmó desde el punto de vista morfológico y funcional que el protocolo quirúrgico que se puso a punto (consistente en una miotomía longitudinal anterior extramucosa del complejo esfinteriano de 1cm de longitud desde el margen anal) lesiona de forma reproducible y sencilla ambos esfínteres. Como método anestésico ideal para los estudios funcionales mediante registro de manometría anorrectal estacionaria (sin estimulación) se eligió la mezcla de ketamina/xylacina intraperitoneal. Para el registro de la actividad motora esfinteriana, se seleccionó la manometría estacionaria con un globo endoluminal relleno de suero salino por ser la que genera un patrón más reconocible y estable. Nuestros controles de calidad constatan que quedan todavía cantidades variables de ASCs tras su paso por el tejido adheridas a la sutura y que no todas las células se adhieren a la misma en su preparación. Ni las lesiones ni los distintos tipos de tratamiento, con y sin la administración de ASCs, modifican de forma significativa la conducta defecatoria de la rata. La terapia celular, independientemente de su forma de administración, es completamente segura para las ratas BDIX. No hay cambios importantes en el peso, ni mortalidad ni eventos adversos relacionables con las células ni asociación significativa de los citados eventos con pertenecer a grupos de terapia celular. Tampoco aparecen cambios histológicos en la zona operada que sugieran ningún riesgo relevante (tumoral, etc.). En la evaluación morfológica, desde el punto de vista macroscópico la presencia de ASCs se asocia con la formación de menos adherencias y fibrosis en las distintas capas y además las adherencias que se forman son más laxas. Desde el punto de vista microscópico, asocia la existencia de menos polimorfonucleares en los cabos de sección muscular y de más macrófagos entre dichos cabos en el primer día postoperatorio. Las suturas recubiertas generan menor infiltrado inflamatorio que las convencionales. Con la inmunofluorescencia objetivamos que las células sobreviven (al menos la primera semana), que están presentes en un porcentaje alto de casos (84.21%) y que son capaces de migrar al foco lesional. No hay datos en nuestro estudio que reflejen la existencia de una regeneración ni un cambio franco del patrón inflamatorio respecto del convencional. En el estudio funcional, aparecen cambios significativos en algunas variables favorables a los grupos de terapia celular pero de dudosa relevancia clínica, sobre todo en la máxima amplitud de contracción a los 15 días postoperatorios y en el área bajo la curva del registro a los 7 y 30 días de la cirugía. Discusión: El procedimiento propuesto es un buen modelo de lesión esfinteriana pero no genera incontinencia en la rata. Habría que valorar otros modelos que se semejen más a la realidad clínica (la incontinencia es multifactorial), quizá orientados a los métodos de parto simulado. Conviene intentar esclarecer el mejor vehículo para el aporte celular, en este estudio se evaluaron las inyecciones (quizá con mayor “control” de la dosis celular aportada) y las suturas recubiertas (que las aportan siempre en la zona “clave”). Los resultados del presente estudio son más discretos que otros publicados en la literatura en este campo y en otros escenarios similares, lo que puede responder a varios factores siendo probablemente uno de los más importantes la escasa casuística en los seguimientos a corto plazo (4 animales para cada período en cada grupo). Se necesitan más estudios que anulen esos factores y con mayor casuística a nuestro juicio. Nuestros resultados morfológicos sugieren una disminución local de cambios de la inflamación aguda en los grupos con células (disminución de la infiltración por neutrófilos) con un potencial cambio precoz hacia hallazgos típicos de la inflamación crónica (aumento de la migración de macrófagos). Aún a pesar de no haber encontrado un claro cambio del patrón inflamatorio, puede que la inmunomodulación sea un mecanismo importante en este campo. Estos hallazgos unidos a que se han encontrado datos similares más consistentes en otros estudios, podrían abrir nuevos horizontes de investigación y ampliar el espectro potencial de aplicación de las ASCs. No se evidenció crecimiento tumoral en ninguna rata (con y sin aporte de células madre) ni reacciones adversas relacionables con las ASCs, por lo que la seguridad de esta terapia en este campo parece garantizada. Conclusiones: La terapia celular es factible y segura en este campo y podría asociar cambios discretos desde el punto de vista morfológico y funcional. PALABRAS CLAVE: Incontinencia fecal, Terapia Celular, ASCs, Células madre, células troncales.