Linfocitos intraepiteliales y células dendríticasdistribución y utilidad en el diagnóstico y en la modulación de la respuesta inmunitaria intestinal

Zusammenfassung

El intestino representa el órgano inmunitario más grande y complejo que existe, sometido a una estimulación constante durante toda la vida tanto por antígenos de la dieta y flora bacteriana comensal, como por microorganismos patógenos oportunistas. Debido a ésto, la mucosa intestinal requiere una respuesta rápida aunque inespecífica para mantener la homeostasis intestinal y proteger al organismo de la entrada de patógenos en caso de que sea necesario. Esta respuesta depende de la inmunidad innata que se complementa con los mecanismos de tolerancia oral. Las principales poblaciones del sistema inmunitario encargadas de mantener la homeostasis son los linfocitos intraepiteliales (LIE) y las poblaciones de la lamina propia (LP). Entre estas últimas destacan las células dendríticas (CD) gracias a que son las células presentadoras de antígeno profesionales más potentes que existen. Los LIE son una población heterogénea y peculiar, compuesta sobre todo por células Tab, Tgd y células natural killer (NK), que se encuentran intercalados entre los enterocitos. Su singularidad, en cuanto a su ubicación, sus vías de desarrollo, su especificidad para reconocer antígenos propios y potencialmente patogénicos, y su especialización funcional con características entre la inmunidad innata y adaptativa, permite a estas células efectoras ser la primera barrera defensiva en un órgano con una gran carga antigénica, además de proteger la integridad de la barrera mucosa. Sin embargo, su estado activado en ambientes pro-inflamatorios sugiere que estas poblaciones pueden contribuir a iniciar y/o exacerbar una respuesta patológica, como ocurre en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la enfermedad celíaca (EC). Nuestro laboratorio de investigación se ha dedicado a lo largo de su trayectoria al estudio de los diferentes mecanismos inmunopatogénicos responsables de estas patologías intestinales, centrándonos en este caso en el papel que pueden tener los LIE en el desarrollo de las enfermedades intestinales inflamatorias. Muchos autores han descrito un aumento de los LIE respecto a las células epiteliales así como una disminución de la población NK en la mucosa duodenal de pacientes celíacos. Dentro de los LIE destaca el aumento que sufre la población de células Tgd que, además, es la única población que permanece aumentada tras la exclusión del gluten de la dieta. El diagnóstico inicial de la EC se realiza generalmente mediante la detección en plasma sanguíneo de anticuerpos anti-TG2. La confirmación del diagnóstico se basa en la demostración causal entre la ingesta de gluten y la enteropatía característica de la enfermedad, considerando el estudio histológico de la biopsia como la prueba de referencia o gold standard. Sin embargo, las alteraciones observadas en la mucosa no son patognomónicas de la EC, y pueden ser observadas también en otras patologías intestinales. Esta falta de especificidad de la biopsia hace que el estudio de las variaciones cuantitativas descritas para los LIE y analizadas por citometría de flujo sea una herramienta eficaz para llegar al diagnóstico de confirmación de la enfermedad. Por ello nos planteamos validar esta técnica en nuestra población de estudio para incorporarla al diagnóstico. Según los resultados presentados en esta tesis, la determinación combinada de las variaciones en las tres poblaciones de LIE estudiadas (aumento de LIE totales, disminución de células NK-like y aumento de las células Tgd) es lo que aporta la mayor especificidad y sensibilidad a esta prueba diagnóstica de la EC. Los porcentajes que obtuvimos para cada una de las subpoblaciones de LIE en cada uno de los grupos de pacientes estudiados fueron muy similares a los obtenidos por otros investigadores, lo que nos permitió validar este método como una herramienta útil en el diagnóstico de la EC y de aplicación beneficiosa en la práctica clínica. La implicación de los LIE en la EC parece clara y está bien documentada. Sin embargo no ocurre lo mismo en la EII. En la respuesta inmunitaria que se produce en la EII existe un ambiente enriquecido en citocinas pro-inflamatorias, fundamentalmente la IL-23, que están implicadas en el desarrollo, activación y supervivencia de diferentes poblaciones de LIE. Liu et al. demostraron recientemente, que los LIE aislados de pacientes con EII tenían una mayor capacidad citolítica frente a las CEI. Todo ello parece sugerir la implicación directa de los LIE en la EII. Aunque no se conoce muy bien el papel que juegan los LIE en los mecanismos inmunopatogénicos de la EII, el estudio de las alteraciones que sufren estas poblaciones puede llevarnos a un mejor conocimiento de la enfermedad, así como al desarrollo de nuevos métodos diagnósticos y de caracterización de pacientes. Por todo ello, nos hemos planteado explorar si en la enfermedad de Crohn (ECr) y la colitis ulcerosa (CU) se producen modificaciones en la distribución normal de las diferentes poblaciones de LIE en la mucosa afectada por la enfermedad y si la determinación de estas modificaciones por citometría de flujo es útil como método de apoyo al diagnóstico diferencial entre ambas entidades y con otras patologías inflamatorias gastrointestinales. Nuestros resultados mostraron que la mucosa afectada por ECr, independientemente de si se trataba de una muestra de colon o de íleon, presentaba un gran aumento de células NK-like al compararlo con el resto de grupos, lo que permitiría diferenciar entre la ECr y el resto de patologías intestinales. Mientras que la EC sólo afecta a la mucosa duodenal, el intestino grueso es el principal tejido afectado por la ECr y la CU. Las poblaciones de LIE se distribuyen de forma diferente en el epitelio del intestino delgado y del intestino grueso. Este patrón de distribución está probablemente influido por las funciones digestivas tan dispares y las condiciones fisiológicas existentes en cada tramo. Sin embargo, el colon siempre ha sido considerado como un único tramo desde el punto de vista anatómico y funcional. Estudios recientes muestran que el colon proximal y distal presentan diferente origen embriológico, vascularización y drenaje linfático, además de una actividad enzimática diferente. Ya dentro del compartimento epitelial, se ha observado que las células epiteliales del colon proximal y del colon distal difieren en su perfil de expresión génica. Por todo ello nos hemos planteado establecer, por citometría de flujo, los valores normales para cada una de las subpoblaciones de LIE en la mucosa intestinal y estudiar si la distribución de estas poblaciones varía a lo largo del tubo digestivo. Según nuestros resultados, dentro del intestino delgado, el compartimento intraepitelial del íleon presenta un mayor porcentaje de linfocitos T, con una mayor proporción de células T CD8+, comparado con el duodeno. Respecto al intestino grueso, los datos obtenidos mostraron que el colon derecho presenta un mayor porcentaje de LIE totales, siendo fundamentalmente linfocitos T CD8+. Sin embargo, el colon izquierdo presenta un aumento de los linfocitos Tgd y de células NK-like respecto al colon derecho, así como de linfocitos T CD4+. Debido a la proximidad entre el colon derecho e izquierdo, decidimos estudiar si estas variaciones en las subpoblaciones de LIE eran debidas a diferencias en la expresión de los ligandos propios de las moléculas que intervienen en los mecanismos de migración de los LIE y las CD a la mucosa intestinal, encontrando diferencias entre ambos tramos del colon. Una de las poblaciones que se encuentra en el compartimento intraepitelial intestinal son las células T natural killer invariantes (iNKT), con características tanto innatas como adaptativas, estando implicadas en los fenómenos de tolerancia oral a pesar de encontrarse en una proporción mucho menor que el resto de poblaciones de LIE. Sin embargo, las alteraciones cuantitativas y/o funcionales de esta subpoblación pueden favorecer la aparición de diversas patologías como la EII y la EC. Los diferentes estudios de cuantificación de células iNKT circulantes e intestinales en pacientes celíacos han dado resultados contradictorios. Hasta el momento no existe un consenso ni acerca del número de las iNKT en el duodeno de los pacientes celíacos, ni acerca de su participación en la etiopatogenia de la enfermedad, por lo que en esta tesis nos hemos planteado evaluar si la población de células iNKT sufre también alteraciones en el compartimento intraepitelial del duodeno afectado por EC y si esta alteración puede favorecer la respuesta patogénica que se produce en la mucosa duodenal. Los resultados obtenidos muestran un aumento de la población de iNKT, con un fenotipo predominante CD4+, en el compartimento intraepitelial del duodeno de los pacientes celíacos. Asimismo, se encontró una correlación entre la expresión de ARNm de Va24 y la gravedad de la lesión de la mucosa, y la expresión de ARNm de IFNg, tanto en condiciones basales como tras la estimulación de biopsias duodenales con gluten. Por último, el balance entre la expresión de ARNm de Va24 y de FoxP3 podría definir un perfil molecular característico de la EC. Como se ha comentado anteriormente, otra de las poblaciones de células que participan en los fenómenos de tolerancia oral y en la respuesta innata son las células dendríticas. Las CD son capaces de responder de forma rápida y eficiente al microambiente en el que se encuentran, lo que les confiere la capacidad de controlar el sistema inmunitario y el balance entre los mecanismos de inflamación y tolerancia. Sin embargo, estas células también están implicadas en la inmunopatogenia de la EC, y son clave en la respuesta adaptativa frente al gluten. Las CD expresan receptores de lectinas de tipo C o CLRs, especialmente DC-SIGN. La mayoría de los ligandos endógenos que se han descrito para DC-SIGN presentan un alto contenido en carbohidratos que al ser reconocidos por el receptor desencadenan determinados mecanismos implicados en los fenómenos de homeostasis intestinal. DC-SIGN también está implicado en fenómenos de diferenciación, reprogramación y expresión de determinados genes codificantes de citocinas que condicionan el fenotipo y la actividad final de las CD. Dado que las CD son uno de los principales componentes de la respuesta inmune en la EC, la señalización a través de DC-SIGN puede tener un efecto directo en la modulación de la respuesta frente al gluten, por lo que decidimos estudiar la expresión de este receptor en la mucosa duodenal. Los resultados obtenidos en esta tesis mostraron que DC-SIGN estaba aumentado en las células de la LP de los pacientes celíacos no tratados. En estos pacientes se observó que todas las células DC-SIGN+ eran HLA-DR+, es decir células presentadoras de antígeno. Por lo tanto, la modulación de la respuesta inmunitaria en los pacientes celíacos utilizando ligandos específicos de DC-SIGN como vehículo de péptidos de la gliadina parece una buena estrategia en el tratamiento inmunoterápico de la EC. Uno de los principales péptidos que se han identificado con capacidad para desencadenar la respuesta adaptativa es el péptido inmunodominante p57-89 de la gliadina (33mer). Por ello, parte de nuestro trabajo se ha centrado en la glicosilación del 33mer para tratar de modular la respuesta pro-inflamatoria producida por el péptido nativo, a través de la señalización mediada por CD DC-SIGN+. Como resumen de nuestros resultados podemos decir, que la glicosilación del péptido 33mer en disposición dendrimérica con ligandos endógenos específicos de DC-SIGN, como son los carbohidratos de tipo Lewis, podría llevar a la modulación de la respuesta pro-inflamatoria generada por el gluten en el duodeno de los pacientes celíacos. Sin embargo hace falta un estudio más exhaustivo para confirmar estos datos. La respuesta adaptativa, mediada por CD, frente al gluten en los pacientes celíacos también engloba una respuesta humoral mediada por linfocitos B. Las células T específicas de gluten, en el contexto de un perfil Th2 de citocinas inducen la proliferación de las células B que se diferencian a células plasmáticas y producen anticuerpos frente a los péptidos desaminados derivados del gluten y frente a la enzima TG2. En este contexto, nuestro grupo de investigación identificó en el plasma de pacientes celíacos, anticuerpos IgA específicos frente a la forma desaminada de un nuevo péptido de 8 aminoácidos (8mer: FPLQPQQP, 8mer desaminado: FPLQPEQP). Este péptido había sido identificado por primera vez en nuestro laboratorio, como un producto específico de la degradación diferencial por proteasas del intestino celíaco. Por todo ello nos propusimos investigar el posible efecto inmunogénico del péptido 8mer en un modelo in vitro de CD de sangre periférica y linfoproliferativo autólogo. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que el péptido desaminado 8mer es capaz de producir una respuesta immunitaria pro-inflamatoria, a través de la activación/maduración de células dendríticas con un perfil complejo de producción de citocinas en el que destacan IL-4, IL-6 y TGFß, y la proliferación de linfocitos T productores de IFNg, independientemente de si la presentación antigénica es mediada por células dendríticas HLA-DQ2+ o DQ2-.