Inmunogenética de la enfermedad celiacapapel de la il-15 y su receptor

Resumen

Introducción La enfermedad celiaca (EC) es una enfermedad inflamatoria sistémica y crónica provocada por las prolaminas del gluten que afecta a individuos genéticamente predispuestos (HLA-DQ2 o HLA-DQ8). El único tratamiento disponible es una dieta sin gluten (DSG) [1]. Las respuestas inmunológicas que tienen lugar en los pacientes con EC están mediadas tanto por la respuesta adaptativa como por la respuesta innata [2]. La respuesta adaptativa se basa en la presentación antigénica de péptidos derivados del gluten por las células dendríticas (DC) a los linfocitos T CD4+, los cuales generan una respuesta proinflamatoria de tipo Th1. La transglutaminasa tisular (TG2) provoca la desaminación de péptidos de gliadina, lo que aumenta la afinidad de éstos por las moléculas HLA, que intervienen en la presentación de antígeno y la activación de los linfocitos T CD4+ [2]. Por otra parte, la respuesta innata frente al gluten se desarrolla en las células epiteliales intestinales (CEI), ya que el gluten es capaz de alterar la expresión génica y el transporte, además de generar situaciones de estrés que se manifiestan por la síntesis de interleucina (IL)-15. Este ambiente inflamatorio promueve que los linfocitos intraepiteliales (LIE) sufran una reprogramación y expresen receptores de células NK, como NKG2D, que reconocen las señales de estrés del epitelio. En consecuencia, destruyen el epitelio, conduciendo a la atrofia vellositaria característica del intestino de los pacientes con EC [2]. La IL-15 es una citocina pleiotrópica que juega un papel fundamental en la patogenia de la EC [3]. Además, sus vías de señalización son únicas, ya que es secretada junto con su receptor específico, IL-15Ralfa, pudiendo señalizar a otras células por transpresentación y de forma paracrina, o en la misma célula que la produce de formas reversa e intracrina [4, 5]. Objetivos En esta tesis nos planteamos estudiar la IL-15 a nivel genético y a nivel de expresión. En el primer caso, el objetivo fue determinar si los genes IL15 e IL15RA se asocian con la EC y qué variantes de splicing de IL-15Ralfa se expresan en el epitelio intestinal. En cuanto a la expresión, quisimos analizar el patrón de expresión de ambas moléculas en el intestino de los pacientes celiacos, además de cuantificar los efectos de IL-15 y otros estímulos en un modelo de epitelio intestinal. Materiales y métodos Para llevar a cabo estos objetivos, se utilizaron muestras de ADN y suero de sangre periférica de individuos sanos y pacientes con EC; así como muestras de biopsias duodenales de pacientes control, de pacientes control patológico no-EC, de pacientes EC (niños y adultos en actividad y adultos en dieta sin gluten) y de pacientes con EC refractaria (ECR). Las técnicas utilizadas fueron el genotipado, el cultivo celular, la clonación y la transfección (incluyendo la PCR, la electroforesis, la restricción enzimática, la transformación de bacterias competentes y el análisis de secuencias), la PCR cuantitativa (qPCR), el análisis de proteínas (western blot y ELISA), la inmunofluorescencia y la citometría de flujo. Resultados Para estudiar la asociación genética de IL15 e IL15RA con la EC, se realizó el genotipado de 48 polimorfismos (SNPs) en 1544 muestras de ADN (728 pacientes con EC) pertenecientes al Consorcio Español para la Genética de la EC (CEGEC). Con ello, se estableció una asociación estadísticamente significativa de 2 SNPs de la región 3¿ aguas arriba de IL15: rs4956400 y rs11100722. También se estudió la relación de los SNPs en un pequeño grupo de pacientes para los que había disponibles datos de expresión de ARNm (qPCR) y de proteína (western blot). El análisis detectó que 8 SNPs de IL15 y 6 SNPs de IL15RA correlacionaban cualitativamente con la expresión de su respectivo gen. Además, se observó que otros 4 SNPs de IL15RA se relacionan de forma diferente en pacientes EC diagnosticados durante su infancia o durante la edad adulta. Por lo tanto, los genes IL15 e IL15RA parecen estar relacionados con la EC. Con el fin de determinar las variantes de splicing alternativo de IL-15Ralfa existentes en el epitelio intestinal humano, se clonaron diferentes secuencias obtenidas de material genético de las células Caco-2 en el vector pCR¿2.1-TOPO® y se obtuvo su secuencia. Para ello se realizaron las técnicas de PCR y electroforesis en gel de agarosa, así como la transformación de bacterias Escherichia coli DH5alfa químicamente competentes. El análisis determinó la existencia de 5 sub-variantes derivadas de las variantes 1, 2 y 3 ya descritas. Sin embargo, ninguna de ellas contiene la secuencia completa del exón 2, clave para la unión de IL-15. Por otra parte, el análisis de células Caco-2 transfectadas con las sub-variantes insertadas en plásmidos pEGFP-N1, que expresarían la sub-variante adosada a la secuencia de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), mostró por inmunofluorescencia y western blot que ninguna de ellas era capaz de seguir la ruta secretora de la célula. Sin embargo, por qPCR de material de células cultivadas en presencia de 5¿ aza-2¿-desoxicitidina (AZA), se hallaron evidencias de que la expresión de estas sub-variantes está regulada por metilación del ADN. Finalmente, no se observaron diferencias de expresión de ninguna sub-variante en muestras de tejido duodenal de pacientes control y pacientes con EC. Para el estudio de la expresión de IL-15 e IL-15Ralfa se realizaron análisis por qPCR y western blot de material procedente de biopsias duodenales de pacientes control y pacientes con EC. Los análisis revelaron un aumento de ARNm de IFN-gamma y de IL-21 en niños con EC y adultos con ECR; así como un incremento de IL-15Ralfa y STAT3 en los pacientes adultos con EC en actividad. Por tanto, la vía de señalización de IL-15 podría estar más activa en pacientes con EC, lo cual resultaría en una disminución del umbral de respuesta a IL-15. Con el western blot de IL-15 observamos niveles inferiores de IL-15 en los pacientes con EC en actividad, y con el western blot de IL-15Ralfa se halla un mayor nivel de IL-15Ralfa en pacientes con ECR respecto a los pacientes adultos con EC en DSG y un menor nivel en estos últimos respecto a los pacientes control. Sin embargo, en ambos western blot, aparecen dos bandas en los que se detecta el complejo IL-15/IL-15Ralfa: la banda de 56 KDa detecta el complejo que sigue la vía secretora y la banda de 40 KDa detecta el complejo que no la continúa. El cálculo del ratio de ambas (56 KDa / 40 KDa), muestra unos valores significativamente mayores para IL-15Ralfa en pacientes con EC en actividad. Por otra parte, la técnica de citometría de flujo permitió detectar una disminución de células epiteliales en el intestino de los pacientes con EC, en especial, en los pacientes con ECR; aunque no se observaron variaciones en la expresión superficial de IL-15 en las células epiteliales. Con la técnica de ELISA se detectó una menor concentración de IL-15 en suero de pacientes con EC, especialmente en pacientes con EC en DSG. Curiosamente, los niveles de IL-15 son mayores en niños que en adultos. Por último, la estimulación de células Caco-2 con IL-15, IFN-gamma, IL-21 o con los péptidos p31-49 y p57-89 derivados de la alfa-gliadina, seguida del análisis de la resistencia transepitelial eléctrica (RTE), indicó que las citocinas IL-15 e IFN-gamma así como los péptidos, impiden un correcto crecimiento de estas células en cultivo. Y en estas condiciones, el estudio por inmunofluorescencia de la proteína zonula occludens (ZO)-1, revela que todas las citocinas y los péptidos alteran las uniones estrechas entre células Caco-2, siendo el péptido p57-89 la molécula que genera un patrón más similar al control positivo: la gliadina pepsinizada-tripsinizada (PT-gliadina). Se observaron también alteraciones de la expresión génica por qPCR, siendo el péptido p31-49 el que más altera la expresión de ARNm de moléculas de estrés (MICA, Hsp70), de moléculas quimioatrayentes (CCL20, CCL28, IL-8), de moléculas relacionadas con CXCL10 (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCR3), del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y de diferentes citocinas (TGF-beta1, TNF-alfa, EBI3, IL-6, IL-17A, IL-18, IL-15 e IL-15Ralfa). El resto de los estímulos tienen efectos más moderados y variados sobre estas moléculas y, además, los efectos se moderan al estimular conjuntamente con IL-15. Ya que muchos de los efectos observados concuerdan con estudios realizados con biopsias de pacientes con EC, las células Caco-2 representan un modelo de epitelio intestinal útil para valorar los efectos de diferentes moléculas sobre el epitelio duodenal de los pacientes con EC. Conclusiones generales El gen IL15 parece asociarse con la EC, mientras que su receptor, IL-15Ralfa, parece colaborar en el establecimiento de un menor umbral de respuesta a esta citocina en la mucosa duodenal de los pacientes con EC. Por otra parte, las células Caco-2 aportan resultados útiles para valorar los efectos de diferentes estímulos sobre células epiteliales intestinales de los pacientes con EC. Bibliografía 1. Husby, S., et al., European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition guidelines for the diagnosis of coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2012. 54(1): p. 136-60. 2. Sollid, L.M. and B. Jabri, Triggers and drivers of autoimmunity: lessons from coeliac disease. Nat Rev Immunol, 2013. 13(4): p. 294-302. 3. Abadie, V. and B. Jabri, IL-15: a central regulator of celiac disease immunopathology. Immunol Rev, 2014. 260(1): p. 221-34. 4. Duitman, E.H., et al., How a cytokine is chaperoned through the secretory pathway by complexing with its own receptor: lessons from interleukin-15 (IL-15)/IL-15 receptor alpha. Mol Cell Biol, 2008. 28(15): p. 4851-61. 5. Budagian, V., et al., IL-15/IL-15 receptor biology: a guided tour through an expanding universe. Cytokine Growth Factor Rev, 2006. 17(4): p. 259-80.