New strategies to develop bioactive cell-harvesting systems based on elastin like recombinamers

Resumen

RESUMEN TESIS DOCTORAL: NEW STRATEGIES TO DEVELOP BIOACTIVE CELL-HARVESTING SYSTEMS BASED ON ELASTIN LIKE RECOMBINAMERS 1. INTRODUCCIÓN Los enfoques tradicionales de la ingeniería de tejidos basados en el uso de estructuras biodegradables han demostrado hasta el momento tener un éxito limitado. Para la reconstrucción de ciertos tejidos como el cardíaco o el hepático es necesario crear estructuras con una alta densidad celular que se asemejen a las arquitecturas nativas manteniendo las interacciones célula-célula y célula-ECM intactas [1]. Las técnicas más convencionales tales como los tratamientos mecánicos o proteolíticos provocan la degradación de las proteínas presentes en la superficie celular, las cuales son vitales para mantener dichas interacciones [2]. Con el propósito de superar estos inconvenientes un logro importante dentro de estas disciplinas es el control a tiempo real y espacial de las interacciones entre determinadas biomoléculas o células con distintos substratos y de la reversibilidad de dichas interacciones. Un excelente ejemplo que permite este firme control son los sistemas ¿inteligentes¿ o capaces de responder a estímulos, los cuales han generado mucho interés científico debido a su potencial para modular su humectabilidad superficial dando lugar a los procesos reversibles de adsorción/desorción de biomoléculas y adhesión/despegue celular [3]. Los sistemas sensibles a estímulos más ampliamente estudiados y con más éxito son las superficies termosensibles basadas en el polímero PIPAAm las cuales permiten la adhesión o el despegue celular sobre ellas a través del control de su hidrofobicidad [4, 5]. Estos sistemas permiten en cierta medida la recolección de forma no invasiva de las células sembradas como entes individuales o como una lámina celular, eliminando la necesidad de utilizar enzimas proteolíticos o procedimientos mecánicos, y preservando las uniones intracelulares así como la organización nativa del tejido [6]. Las células recolectadas pueden ser depositadas sobre otro material tal como una nueva placa de cultivo, otra lámina celular o tejido biológico. Sin embargo, estos sustratos presentan algunos aspectos que son potenciales fuentes de pérdida de eficiencia y robustez como una falta de efectividad y control total de las propiedades de adhesión celular, una dependencia de la adsorción de proteínas presentes en el medio de cultivo, un espesor de la capa injertada muy restringido, una imposibilidad de reutilización del sistema y una necesidad de co-inmovilizar otras moléculas para modular sus propiedades termosensibles. En base a esto, se planteó el desarrollo de plataformas basadas en superficies con propiedades más directas y controladas en términos de adhesión celular y en la conmutación entre un estado activo y uno inactivo, con el objetivo de conseguir sistemas con capacidad de responder a estímulos externos para la recolección de células individuales y de láminas de células más efectivos, robustos y universales. Se propuso como una buena aproximación para lograr este objetivo la síntesis de superficies funcionales a través de la unión de un conjunto de Recombinámeros tipo Elastina (ELRs) termosensibles sobre substratos comunes mediante enlace covalente que asegure la eficacia del sistema y su capacidad de reutilización. 2. CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN El trabajo recopilado en esta tesis, es parte de un proyecto a largo plazo centrado en la mejora de las herramientas proporcionadas por la ingeniería genética para el diseño de novedosos ELRs con funciones específicas y bioactividad hacia el desarrollo de una estrategia eficiente para la funcionalización de superficies. El objetivo es que dichas superficies constituyan un sistema óptimo de recolección celular dirigido por simples cambios de temperatura basado en el comportamiento ¿inteligente¿ de los ELRs con potenciales aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Los Recombinámeros tipo Elastina (ELRs) [7] son un importante ejemplo de polímeros sensibles a la temperatura, los cuales combinan unan complejidad secuencial y arquitectónica con diversas bioactividades diseñadas a demanda, junto con propiedades estructurales, morfológicas, físicas, biológicas y mecánicas de interés. Además, los ELRs presentan una gran biocompatibilidad, baja toxicidad e inmunogenicidad, a un bajo coste desempeñando un significativo papel en la síntesis de biomateriales avanzados [8]. De este modo, en primer lugar, este trabajo presenta el acondicionamiento de diferentes herramientas proporcionadas por la ingeniería genética para primero, la obtención de ELRs en organismos modificados mejorando los rendimientos de producción y facilitando su proceso de purificación, y segundo, la introducción de distintas funcionalidades dentro de la estructura primaria de cualquier recombinámero. A partir de aquí, se diseñan a nivel génico y se producen los ELR funcionales caracterizados por contener la secuencia bioactiva RGD y tres residuos de lisina en el extremo N-terminal y sus respectivos controles. A continuación se purifican mediante ciclos de temperatura inversa y se analiza su pureza, junto con sus propiedades físico-químicas. Posteriormente, los recombinámeros caracterizados son injertados sobre las superficies de vidrio mediante la reacción de Click Chemistry entre grupos alquinilo y grupos azido, la cual proporciona la unión covalente entre ambos grupos en forma de triazoles. La elección de dicha reacción para la unión covalente de los polímeros sobre las superficies estuvo de terminada por su regioespecificidad, altos rendimientos, amplio rango de pH, temperaturas y solventes (incluido el agua), y muy importante en este caso la biocompatibilidad demostrada por sus productos [9, 10]. Las superficies funcionalizadas resultantes fueron caracterizadas en términos de composición, estabilidad, rugosidad, espesor, y homogeneidad (XPS, TOF-SIMS, análisis de fluorescencia, y AFM) para determinar la eficiencia de la reacción y en términos de humectabilidad (ángulo de contacto) a diferentes temperaturas con la finalidad de comprobar si las superficies mantienen el carácter termosensible propio de los ELRs. Consecutivamente, se realizaron diferentes ensayos con varias líneas celulares para determinar la capacidad adhesiva de las superficies recubiertas por los diferentes recombinámeros y su habilidad para la liberación tanto de células individuales como de una lámina celular con un simple cambio de temperatura ambiental. Asimismo se analizó la viabilidad y proliferación celular después de tratamiento térmico mediante microscopia de fluorescencia, y ensayos colorimétricos. Posteriormente, se optimizó el protocolo de recolección celular desde estos nuevos sustratos mediante la reducción de la etapa de enfriamiento y la introducción de una etapa adicional y breve de calentamiento a 37 ºC que tiene en cuenta ciertas propiedades recientemente descritas en la literatura en relación a la biología celular del despegue [5, 11]. Esta nueva etapa de calentamiento hizo posible la activación de determinadas rutas metabólicas que impulsan el despegue activo y eficiente con la correspondiente remodelación del citoesqueleto y por tanto de su morfología. Este nuevo protocolo fue evaluado con diferentes líneas celulares (HFF-1 y ADSCs) las cuales verificaron su eficiencia demostrando su idoneidad y versatilidad para el crecimiento y la recolección de diversos tipos celulares. Finalmente, este trabajo exploró la técnica de Microcontact Printing (¿CP, Impresión por microcontacto) [12, 13] en combinación con la Click Chemistry [14] como una herramienta versátil para el modelado y funcionalización de superficies con el propósito de analizar si es posible el despegue celular topográficamente selectivo. Para ello, se imprimieron a nivel micrométrico estampados de dos recombinámeros biactivos diferentes, uno que mantiene las propiedades termosensibles después de la inserción y otro que ha perdido esta capacidad sobre las superficies de vidrio modificadas. 3. CONCLUSIONES - La combinación de las ventajas de dos vectores de expresión diferentes permitió obtener nuevas herramientas útiles para incrementar la producción y mejorar los procesos de purificación tanto de los ELRs desarrollados en este trabajo como de otros que se desarrollen en el futuro. Estas herramientas demostraron poseer idóneas propiedades de clonaje y expresión, además de proporcionar una estabilidad bacteriana superior y permitir la producción basal del recombinámero. A través de una reacción de mutagénesis sitio-dirigida se consiguió que estos vectores fueran también útiles para la introducción de tres residuos de lisina con su correspondiente grupo reactivo ¿-amino en el extremo N-terminal, C-terminal o en ambos dentro de la secuencia de aminoácidos de cualquier recombinámero cuya secuencia génica sea insertada dentro de uno de estos tres vectores especiales de expresión. Estas herramientas dan la oportunidad de generar en el futuro moléculas multifuncionales con funciones avanzadas. - Se ha demostrado de forma exitosa que la química de superficies usada en este trabajo supone una estrategia eficiente para la funcionalización de sustratos convirtiéndolos en termosensibles. De esta forma, ELRs con el motivo bioactivo RGD y extremos portadores de grupos amino reactivos pueden ser fácilmente y eficazmente injertados mediante Click Chemistry sobre las superficies de vidrio. - Distintos ensayos celulares demostraron que los cambios confomacionales dependientes de la temperatura exhibidos por las superficies poliméricas inducen modificaciones en la capacidad de adhesión celular entre dos estados opuestos: adherente y repelente, los cuales son coincidentes con diferentes estados de humectabilidad superficial. Sin embargo, los diferentes controles utilizados en este trabajo proporcionan una fuerte evidencia de que este comportamiento depende de la interacción directa entre los dominios de adhesión celular presentes en la molécula y las integrinas de la superficie celular, y no de los cambios en las propiedades físicas superficiales. De esta manera, este trabajo ha demostrado que la creación de un sistema de recolección celular eficiente basado en los ELRs requiere, primero una intrínseca funcionalidad de adhesión celular proporcionada por la inclusión de dominios que promueven la adhesión celular, como el RGD, en este caso. En segundo lugar, se ha de tener en cuenta el adecuado posicionamiento de estas funcionalidades dentro de la cadena polimérica para que los cambios conformacionales dirigidos por la temperatura permitan la conmutación entre un estado adhesivo y uno antiadherente. Otro factor que ha resultado ser relevante, es una eficiente capacidad de anclaje a las superficies por parte de los recombinámeros, la cual debe de ser reforzada y favorecida por un incremento en el número de grupos reactivos en uno de los extremos de las cadenas poliméricas. - Los ensayos de viabilidad y proliferación celular pusieron de manifiesto la idoneidad y la biocompatibilidad de estos sistemas de recolección celular después del tratamiento a baja temperatura. - La optimización del protocolo de recolección celular desde estos nuevos sustratos fue conseguido mediante la reducción de la etapa de enfriamiento y la introducción de una etapa adicional y breve de calentamiento a 37 ºC que tiene en cuenta ciertas propiedades recientemente descritas en la literatura en relación a la biología celular del despegue. Se demostró que el paso reducido de enfriamiento permite que se lleven a cabo los cambios conformacionales de las cadenas poliméricas ancladas a la superficie induciendo el despegue celular pasivo. Sin embargo, la etapa de calentamiento hace posible la activación de determinadas rutas metabólicas que impulsan el despegue activo y eficiente con la correspondiente remodelación del citoesqueleto y por tanto de su morfología. Los análisis de la capacidad de liberación celular con diferentes líneas celulares (HFF-1 y ADSCs) verificaron la eficiencia de este nuevo protocolo demostrando su idoneidad y versatilidad para el crecimiento y la recolección de diversos tipos celulares con diferentes tasas metabólicas. - Este trabajo también reveló que este protocolo optimizado permite la generación de láminas celulares cuando las células son crecidas hasta alcanzar la confluencia. Las monocapas celulares pueden ser fácilmente manipuladas con una membrana de soporte (PVDF) mediante interacciones físico-químicas, y transferidas directamente a una nueva placa de cultivo. De este modo, la lámina de células puede ser implantada sobre tejido biológico, o incluso directamente sobre heridas poniendo de manifiesto las excelentes propiedades de estas plataformas para aplicaciones dentro de la ingeniería de tejidos. A parte de esto, se debe destacar la presencia de motivos bioactivos dentro de las secuencias de los ELR, los cuales se mantienen anclados a las superficies y no acompañan a las células libreadas. Esto permite una rápida recolección de células individuales y de láminas celulares en medio de cultivo sin suero, y sin el uso de ningún aditivo extra evitando la exposición de patógenos de origen animal en adicionales aplicaciones clínicas. - Por último, este trabajo mostró la posibilidad de generar estampados a nivel micrométrico de ELR bioactivos con geometrías perfectamente definidas sobre superficies de vidrio que exhiben un despegue celular topográficamente selectivo. Por tanto, estos sustratos pueden constituir un sistema de adhesión/despegue celular eficiente, temporal y espacialmente controlable. Estos ensayos representan un limitado ejemplo de las posibilidades que podrían ser desarrolladas en el futuro gracias a la generación de los ELR mediante técnicas de ingeniería genética y al diverso potencial de la microfabricación. 4. REFERENCIAS 1. Hannachi, I.E., M. Yamato, and T. Okano, Cell sheet technology and cell patterning for biofabrication. Biofabrication, 2009. 1(2): p. 022002. 2. Canavan, H.E., et al., Cell sheet detachment affects the extracellular matrix: A surface science study comparing thermal liftoff, enzymatic, and mechanical methods. J Biomed Mater Res Part A, 2005. 75A(1): p. 1-13. 3. Cole, M.A., et al., Stimuli-responsive interfaces and systems for the control of protein-surface and cell-surface interactions. Biomaterials, 2009. 30(9): p. 1827-1850. 4. Okano, T., et al., A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res, 1993. 27(10): p. 1243-51. 5. Okano, T., et al., Mechanism of cell detachment from temperature-modulated, hydrophilic-hydrophobic polymer surfaces. Biomaterials, 1995. 16(4): p. 297-303. 6. Nagase, K., J. Kobayashi, and T. Okano, Temperature-responsive intelligent interfaces for biomolecular separation and cell sheet engineering. J R Soc Interface, 2009. 6(Suppl 3): p. S293-S309. 7. Rodriguez-Cabello, J.C., et al., Recombinamers: combining molecular complexity with diverse bioactivities for advanced biomedical and biotechnological applications. Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol., 2011. 125: p. 145-79. 8. Rodríguez-Cabello, J.C., et al., "Recombinamers" as advanced materials for the post-oil age. Polymer, 2009. 50(22): p. 5159-5169. 9. Hein, C., X.-M. Liu, and D. Wang, Click Chemistry, A Powerful Tool for Pharmaceutical Sciences. Pharmaceut Res, 2008. 25(10): p. 2216-2230. 10. Kolb, H.C., M.G. Finn, and K.B. Sharpless, Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl, 2001. 40(11): p. 2004-2021. 11. Yamato, M., et al., Signal transduction and cytoskeletal reorganization are required for cell detachment from cell culture surfaces grafted with a temperature-responsive polymer. J Biomed Mater Res, 1999. 44(1): p. 44-52. 12. Delamarche, E., et al., Positive Microcontact Printing. J Am Chem Soc, 2002. 124(15): p. 3834-3835. 13. Bernard, A., et al., Microcontact Printing of Proteins. Adv Mat, 2000. 12(14): p. 1067-1070. 14. Rozkiewicz, D.I., et al., "Click" chemistry by microcontact printing. Angew Chem Int Ed Engl, 2006. 45(32): p. 5292-6.