Función de la apolipoproteína d en la mielinización y en la respuesta al daño en el sistema nervioso periférico

Resumo

Apolipoproteína D (ApoD) es una proteína extracelular perteneciente a la familia de las lipocalinas que se expresa en el sistema nervioso durante su desarrollo embrionario y postnatal. Esta expresión aumenta con el envejecimiento y con la aparición de múltiples patologías neurodegenerativas. Los resultados derivados del análisis genético de ApoD en ratón, y de los genes homólogos de ApoD en la mosca Drosophila (GLaz y NLaz), han demostrado que ApoD ejerce una función protectora en respuesta al daño celular causado por estrés oxidativo (Ganfornina et al. 2008; Hull-Thompson et al. 2009; Sanchez et al. 2006). Esta función se pone de manifiesto cuando el estrés oxidativo es aplicado experimentalmente y cuando es un proceso fisiológico que acompaña al envejecimiento, a enfermedades neurodegenerativas o a lesiones nerviosas. El sistema nervioso central (CNS) es uno de los principales lugares de síntesis de ApoD, donde parece realizar importantes funciones en el mantenimiento de la homeostasis celular y en la respuesta al estrés. Existen numerosos estudios acerca de la posible función de ApoD en el CNS y su mecanismo de acción comienza a comprenderse a partir de los últimos datos experimentales en organismos modelo. Sin embargo, poco se conoce sobre la función de ApoD en el Sistema Nervioso Periférico (PNS). En los años 90 se describió que, en condiciones normales, ApoD es expresada por las células de Schwann y los fibroblastos y que su expresión aumenta tras la lesión del nervio ciático de rata (Boyles et al. 1990; Spreyer et al. 1990). Durante la degeneración del nervio que ocurre después de una lesión, se produce la degradación de la vaina de mielina, liberándose gran cantidad de lípidos que son captados por los macrófagos y las células de Schwann. Este fenómeno coincide con un incremento local de los niveles de ApoD y ApoE (Boyles et al. 1990). Para estas apolipoproteínas se propuso la hipótesis de captación, transporte y reutilización de los lípidos liberados tras el daño, contribuyendo a la biosíntesis de las vainas de mielina durante el proceso de regeneración y remielinización de los axones dañados. Sin embargo, en un estudio reciente se ha comprobado experimentalmente que la función de ApoD precede a los fenómenos de regeneración y remielinización (Ganfornina et al. 2010). Usando ratones knock-out para ApoD (ApoD-KO) y transgénicos que sobre-expresan ApoD humana (hApoD-Tg) se ha demostrado que la ausencia de ApoD: (1) disminuye la velocidad de conducción del nervio y el grosor de la vaina de mielina en nervios intactos, (2) retrasa la retirada de los restos de mielina de la zona lesionada por las células de Schwann y los macrófagos, y (3) provoca un aumento del número de macrófagos reclutados a la zona de la lesión. Como consecuencia, los procesos de regeneración axonal y remielinización se enlentecen. Este trabajo es el antecedente inmediato del que parte el trabajo realizado en esta tesis, cuyo objetivo es conocer la función y el mecanismo de acción de ApoD en el proceso de degeneración que tiene lugar tras la lesión de nervio periférico, así como su función en la mielinización y mantenimiento de la mielina del PNS. Como se ha mencionado, en ausencia de ApoD acuden más macrófagos a la zona del daño tras una lesión en el nervio ciático. Por lo tanto, cabría esperar que la fagocitosis de mielina ocurriera más rápido que en situación control, pero no es así. Las hipótesis de partida acerca de la función de ApoD en este proceso son: I. ApoD participa en la presentación de restos lipídicos a células de Schwann y macrófagos. II. ApoD funciona como una señal extracelular que modula el reclutamiento de macrófagos a la zona del daño, directamente o regulando la activación de cascadas que controlan la expresión de otros genes. III. ApoD participa en el proceso de mielinización regulando las propiedades de la mielina y esto la hace más o menos fagocitable. Para contrastar las hipótesis I y II se han usado tres aproximaciones experimentales: 1. In vitro: Ensayos de fagocitosis de mielina en cultivos de macrófagos peritoneales de ratones WT y ratones ApoD-KO, y cuantificación de la fagocitosis por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. 2. In vivo: Modelo de daño por pinzamiento del nervio ciático en ratones WT y ratones ApoD-KO en el que se ha monitorizado la expresión de moléculas implicadas en el reclutamiento de macrófagos y en la fagocitosis de mielina por qRT-PCR, inmunoblot e inmunohistoquímica. 3. Ex vivo: Explantes de nervio ciático de ratones WT y ApoD-KO para el estudio del proceso de degeneración Walleriana en ausencia de macrófagos. Los resultados obtenidos demuestran que: (1) las células de Schwann son el principal tipo celular productor de ApoD tras una lesión en nervio periférico, (2) ApoD modifica las propiedades de la mielina que influyen en la dinámica de la interacción entre macrófagos y mielina, (3) ApoD regula la señalización entre las células de Schwann y los macrófagos, aumentando el reclutamiento de macrófagos dependiente de Tnf¿ y MCP1, así como su activación, (4) la ausencia de ApoD resulta en un mayor nivel basal de ácido araquidónico (AA) y una mayor disminución de AA inducida por el daño. Esto se traduce en el mantenimiento de un fenotipo pro-inflamatorio y fagocítico en los macrófagos infiltrados. Estos resultados indican que el control por ApoD de la disponibilidad de AA es un mecanismo fundamental que controla la señalización entre células gliales y macrófagos y condiciona la resolución de la lesión. Por último, para estudiar la función de ApoD en el proceso de mielinización (hipótesis III) se ha realizado un estudio comparado de nervio ciático de ratones WT y ratones ApoD-KO durante el proceso de mielinización. Se ha medido la expresión de varias proteínas de la mielina (Mbp y Mag) por qRT-PCR e inmunoblot en nervio ciático de ratones de 3, 10 y 25 días y se ha realizado también un análisis lipídico y un estudio de la estructura de la mielina del CNS mediante microscopía electrónica. Los resultados demuestran que (1) la expresión de ApoD en el nervio ciático aumenta durante el proceso de mielinización postnatal, (2) la falta de ApoD provoca cambios en la expresión, a nivel transcipcional, de las proteínas de la mielina Mbp y Mag, y del principal factor de transcripción que regula el proceso de mielinización, Krox20, (3) ApoD regula las cantidades de Mbp y fosfatidilinositoles presentes en la mielina y (4) la falta de ApoD provoca anomalías en la compactación de la mielina. Todos estos resultados demuestran que la función de ApoD es importante tanto para el desarrollo y mantenimiento de la mielina, como para la regulación de los procesos de señalización que controlan la resolución de la respuesta inflamatoria tras una lesión en nervio periférico.