Relación de la apolipoproteína d y sus homólogos en drosophila con las membranas biológicas. Estudio de su función en diferentes procesos celulares y de su localización y efectos sobre las balsas lipídicas

Resumen

La apolipoproteína D (ApoD) es un Lipocalina secretada principalmente por células gliales cuya expresión aumenta con el envejecimiento y la neurodegeneración. Lazarillo Glial (GLAZ) y Lazarillo Neural (NLaz) son homólogos de ApoD en Drosophila. ApoD protege contra el estrés oxidativo y promueve la regeneración axonal después de una lesión, pero su mecanismo de acción es desconocido. ApoD se encuentra entre un pequeño conjunto de genes cuya sobre-expresión con el envejecimiento del sistema nervioso está evolutivamente conservada, y dicha sobre-expresión se correlaciona estrechamente con un amplio espectro de daño al sistema nervioso, como apoplejía, trastornos psiquiátricos y enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson, Huntington o la enfermedad de Niemann Pick. Se ha propuesto que su función protectora podría deberse a una posible capacidad de contrarrestar la peroxidación lipídica. En esta tesis se plantea la hipótesis de que GLaz/NLaz/ApoD pueda modular la composición de la membrana, la dinámica y la oxidación. Para contrastar esta hipótesis se estudiaron los efectos de estas lipocalinas en diferentes procesos en los que la membrana juega un papel importante. Los dos factores causales más importantes del envejecimiento fisiológico y la neurodegeneración son (1) las especies reactivas de oxígeno (ROS) y (2) el deterioro de los sistemas de control de calidad de proteínas y orgánulos. Experimentos anteriores habían demostrado la capacidad de GLaz de contrarrestar algunos de los efectos neurodegenerativos de una enfermedad basada en la disfunción mitocondrial principalmente debida a un desequilibrio redox, la Ataxia de Friedreich, al reducir el nivel de peroxidación de lípidos y ácidos grasos libres. El primer objetivo en este trabajo es estudiar el efecto de estas lipocalinas en el segundo factor, el deterioro de los sistemas de control de calidad de proteínas y orgánulos. Para ello se generó un modelo de degeneración de la retina de Drosophila basado en una proteinopatía por poli-Q, Ataxia Espinocerebelosa tipo I (SCA1), combinado con diversas formas de sobre-expresión de NLaz y GLaz. Hasta ahora, no había sido probada la capacidad de ninguna Lipocalina de modificar una neurodegeneración basada por poli-Q. Tanto NLaz como GLaz han demostrado ser parte de la respuesta protectora transcripcional endógena contra la neurodegeneración. La sobre-expresión de GLaz y NLaz rescata la neurodegeneración por poli-Q y dichos efectos beneficiosos parecen persistir durante el envejecimiento pudiendo llevarse a cabo de una manera autocrina y paracrina. La ganancia de función de GLaz en este modelo promueve la eliminación de proteínas ubiquitinadas, disminuye la expresión de Atg8 y reduce la acumulación de la proteína p62 (ambas proteínas autofágicas) reduciendo con ello la muerte celular apoptótica. GLaz podría logra esta protección promoviendo el flujo de los últimos pasos de la autofagia, no su inducción, incluso cuando se combina con inducciones farmacológicas de la autofagia. Además, GLaz disminuye la inducción del gen Gsts1 frente a la neurodegeneración por SCA1, un modificador genético de SCA1 que contribuye a la eliminación de lípidos peroxidados, con lo que los efectos beneficiosos de GLaz estarían vinculados al aclaramiento de dichos lípidos peroxidados. Los resultados sugieren que GLaz entra en las neuronas en degeneración por endocitosis y promueve la resolución de la autofagia, aumentando su flujo y ayudando a limpiar los agregados de proteínas inducidas por poli-Q. El estudio de la internalización de ApoD en astrocitos en cultivo ha revelado que ApoD se endocita y localiza en los lisosomas donde podría actuar sobre los procesos que ocurren dentro de la célula, como el flujo de la autofagia. Dado que existe un homólogo de ApoD unido a la membrana a través de un dominio de unión a membrana GPI, Lazarillo de saltamontes, cuya pérdida de función causa un defecto en el crecimiento de los axones, el siguiente objetivo fue el estudio de la posible conservación de este fenotipo en los homólogos secretados. El análisis del crecimiento axonal de cultivos primarios neuronales de Drosophila en ausencia de NLaz y GLaz ha revelado una disminución en la longitud de los axones en comparación con los cultivos de control, y una disminución en el número de sinapsis establecidas y su área. Este resultado confirma la existencia de un mecanismo conservado de acción fuertemente asociada con las membranas. El hecho de que este fenotipo esté conservado en Lazarillo (unido por GPI a la membrana) y sus homólogos secretados, el hecho de que las membranas lisosomales son ricas en balsas lipídicas y que las proteínas GPI se encuentran unidas a estos dominios sugiere que ApoD y sus homólogos secretados pueden estar vinculados específicamente a las balsas lipídicas. La última parte de este trabajo se centró en la posible interacción ApoD y las membranas y el efecto de esta lipocalina en ellos. A pesar de ser una proteína secretada, ApoD tiene una fuerte interacción con membranas. ApoD se comporta como una proteína de membrana periférica asociada a los dominios de membrana resistentes a detergente de una manera estable e independiente de las especies. Específicamente ApoD aparece vinculada a los dominios de membrana extraídos por Triton X-114 caracterizados como dominios de membranas intercelulares ricos en gangliósidos. No se observaron diferencias en las cantidades de colesterol o esfingomielina al comparar las balsas lipídicas de las membranas WT y ApoD-KO. Del mismo modo, no existen diferencias notables en el perfil de proteínas de las balsas lipídicas en ausencia de ApoD. Sin embargo, el análisis de las fracciones de las balsas con espectroscopía Raman muestra cambios conformacionales en sus estructuras moleculares y un desorden molecular debido a la falta de ApoD. Un estudio lipidómico con espectrometría UPLC-masas muestra cambios significativos en la composición lipídica entre las balsas de hipocampos de ratones WT y ApoD-KO tratados con paraquat, una droga pro-oxidante. ApoD modifica específicamente el metabolismo de gangliósidos en respuesta al estrés oxidativo que resulta en modificaciones de la composición de monohexosilceramidas, esfingomielinas y ceramidas que constituyen las balsas lipídicas. Estos resultados confirman una relación directa entre una proteína secretada, ApoD, y la composición de la membrana, y enlazan específicamente la función ApoD a las balsas de lípidos, un dominio de membrana involucrado en un gran número de procesos de señalización celular. Esta nueva ubicación de ApoD y su increíble interacción con membranas abre nuevas líneas de investigación que acercan el mecanismo de acción de ApoD a las membranas tanto plasmática como las membranas intracelulares. También apunta a los procesos en los que estas estructuras están involucradas, confiriendo a ApoD un amplio espectro de posibilidades para ejercer su función de protección, convirtiendo a ApoD en una herramienta de gran potencial.