Functionality development in sytems based on elastin-like recombinamersfrom nano-objects to macrogels

Resum

La adquisición de un conocimiento profundo de los biomateriales requiere entender el papel desempeñado por los mismos en las diversas aplicaciones, tanto en ingeniería de tejidos como en nanotecnología. Por otro lado el desarrollo de nuevas generaciones de materiales es cada vez más esencial para el éxito de dichas aplicaciones específicas. El desarrollo y correcto uso de los nuevos biomateriales se basa hoy en día en la aplicación de los mismos principios presentes en la naturaleza, es decir, mimetizando las características y funciones de las proteínas naturales podremos desarrollar un nuevo sistema de biomateriales con excelentes propiedades que satisfagan las necesidades intrínsecas de la aplicación. La opción fundamentada en los Recombinámeros Basados en Proteínas (RBP) abrió una nueva era en los biomateriales mientras que la profunda relación entre las técnicas de la biología molecular y la obtención de proteínas recombinantes nos ha conducido a una etapa donde somos capaces de diseñar cualquier polímero polipeptídico que exhiba cualquier tipo de función. Jugando con la composición y secuencia aminoacídica se puede obtener un biomaterial con las características mecánicas, químicas y biológicas esenciales para su aplicación específica. En las últimas décadas se han desarrollado varias familias de RBPs fundamentados en las secuencias aminoacídicas específicas encontradas en las proteínas naturales. Usando estas secuencias mimetizamos la función de la proteína originaria y podemos ir incluso más lejos, desarrollando materiales híbridos basados en más de una proteína nativa que exhiban varias funciones y logrando así el objetivo de crear un biomaterial multifuncional. Entre estas nuevas generaciones de materiales poliméricos hay una familia específica de RBPs que muestran características interesantes en el campo de los biomateriales: los Recombinámeros Tipo Elastina (ELRs acrónimo del inglés Elastin Like Recombinamers). Se basan en la repetición de ciertos motivos peptídicos cortos que se consideran como las unidades estructurales básicas de la elastina natural. La secuencia más representativa de estos monómeros es el pentapéptido (VPGVG) que se repite hasta once veces sin una sola substitución en la elastina nativa bovina; y la mayor parte de los ELRs descritos en la literatura proceden de modificaciones o de permutaciones específicas de este pentámero. Además de su biocompatibilidad y bioprocesabilidad, demuestran un comportamiento inteligente de auto-ensamblado relacionado con su naturaleza elastomérica. Dicho proceso consiste en una transición de fase reversible en respuesta a cambios en la temperatura basada en la Transición Inversa con la Temperatura (ITT), definida por la temperatura de transición (Tt) específica para cada ELR. En una solución acuosa por debajo de la temperatura de transición Tt, las cadenas libres del polímero están desordenadas e hidratadas hidrofóbicamente, sin embargo, por encima de la Tt, las cadenas se auto-ensamblan por interacciones hidrófobas y forman un nuevo estado de fase separado del disolvente. Cuando las cadenas del polímero se ensamblan adoptan una estructura dinámica, regular llamada ß-espiral; simplificando, el polímero transforma energía térmica en trabajo mecánico. Esta conversión de energía se puede modular controlando la secuencia del polipéptido, de igual manera el polímero puede también responder a otros estímulos como la concentración salina, el pH, la presión, el potencial redox, etc. En el grupo de investigación BIOFORGE estamos no sólo interesados en desarrollar ELRs que respondan a un estímulo específico sino también en dotar a los nuevos polipéptidos de secuencias específicas para que puedan convertirse en materiales excelentes en el área de la biomedicina. El trabajo desarrollado a lo largo de este doctorado forma parte de un proyecto a largo plazo centrado en la comprensión de los fundamentos moleculares de los ELRs, el desarrollo de nuevos ELRs con funciones específicas, y el uso de sistemas basados en ELRs. Al construir una casa son necesarios diversos materiales y conocimientos para que la construcción final aguante el paso del tiempo, lo mismo es aplicable al desarrollar nuevos biomateriales. Para obtener ELRs que puedan utilizarse con éxito como biomateriales, es esencial aplicar conocimientos de diversas áreas como la química, la física y la biología. Dentro del trabajo desarrollado en esta tesis doctoral estos principios han estado siempre presentes así que los ELRs desarrollados constituirán las primeras piedras de un proyecto más ambicioso y factible. La búsqueda de procedimientos respetuosos con el medio ambiente ha sido también una prioridad y un objetivo; las herramientas de la biología molecular junto con la biotecnología han permitido la obtención de varios ELRs de una manera barata y pero sobretodo mucho más limpia. La adaptación de la tecnología del DNA recombinante en el campo de los ELRs fue el punto de partida para todo el trabajo desarrollado. La ingeniería genética permite la generación de nuevos genes con control exacto sobre su secuencia, y esto es extremadamente útil dado que la mayor parte de los usos de los biomateriales son dependientes del tamaño y de la secuencia de la proteína. Para obtener ELRs en organismos modificados, así como para generar las secuencias codificantes, fue necesario cambiar algunas de las herramientas proporcionadas por la biología molecular; lo que incluyó mutagénesis sitio-dirigida y la generación de un nuevo vector de clonaje. Con estas nuevas herramientas disponibles el paso siguiente fue la obtención de un conjunto de ELRs con funcionalidades y usos específicos según su secuencia aminoacídica. El primer objetivo fue obtener una serie de copolímeros en bloque, di y tribloques, que se auto-ensamblan originando nano y microestructuras definidas según la disposición de los bloques, su tamaño y de las condiciones del medio. Para la construcción de los genes fue necesario primero obtener un bloque apolar hidrófobo que respondiera a cambios en la temperatura y presentara histéresis; el otro bloque, dependiente al mismo tiempo de la temperatura y del pH, fue previamente obtenido en nuestro grupo. La presencia de aminoácidos específicos que cambian su polaridad con la variación en el pH del medio abre la posibilidad de desarrollar materiales inteligentes que responden a más de un estímulo. Además de los estudios que se realizaron para comprobar las nanoestructuras formadas por los nuevos copolímeros en bloque también se estudió la optimización de los procesos de bioproducción de los polímeros. Uno de los objetivos principales en el campo de los biomateriales es el desarrollo de materiales con complejidad creciente en función de su aplicación, de modo que materiales más complejos sirvan para realizar funciones más complejas. La inclusión de secuencias peptídicas bioactivas permite obtener ELRs aplicables eficazmente en los usos biomédicos más diversos. El desarrollo de ELRs para injertos óseos era otro de los objetivos, para ello una secuencia específica encontrada en la proteína estaterina de la saliva humana se incluyó en la secuencia del polímero creando un ELR que permitiera inducir la formación de cristales de hidroxiapatita, lo cual es esencial al trabajar con substitutos para injertos óseos pues, se ha descrito que, el tamaño y la forma de los cristales de hidroxiapatita influencia o determina el éxito del injerto. Creando copolímeros en bloque, constituidos por el bloque con la secuencia bioactiva junto con el bloque apolar e hidrófobo obtenido previamente, se abrió la posibilidad de estudiar cómo la distribución espacial de la secuencia bioactiva afecta a la formación de los cristales. Por último, y puesto que la secuencia bioactiva está estrechamente vinculada con la ingeniería de tejido del hueso, se obtuvo un ELR híbrido conteniendo, además de la secuencia que induce la formación de cristales de hidroxiapatita, la secuencia RGD para la adhesión celular. Con este ELR fue creado un biomaterial de función múltiple que inducirá la formación del componente principal de la parte inorgánica del hueso y al mismo tiempo promoverá la adhesión celular de células óseas. Los dos últimos ELRs desarrollados fueron creados específicamente para ingeniería tisular, la cual apunta a la regeneración de tejidos naturales y la creación de nuevos tejidos sanos. La obtención de soportes y superficies bioactivas son esenciales al desarrollar un nuevo tejido. La ingeniería de tejidos óseos busca el desarrollo de substitutos viables que restauren y mantengan la función del hueso. Manteniendo las características mecánicas y la biocompatibilidad de los ELRs se obtuvo un nuevo polímero con el objetivo de ser usado como materia prima para formación de matrices bioactivas, dicho polímero contiene una secuencia específica encontrada en el colágeno, responsable de la adhesión, migración, diferenciación celular e iniciación de una cascada de acontecimientos que conlleva a la formación nuevo tejido óseo. Por último, fue obtenido un ELR con un dominio bioactivo procedente de la proteína de la matriz extracelular (ECM) laminina, que apoyará la supervivencia, adhesión, proliferación y orientación de células neuronales. El éxito de todo soporte polimérico en la ingeniería de tejido depende de varios factores como la química de los biomateriales empleados, de las células, de la presencia de biomoléculas específicas, de la topografía y de las características mecánicas inherentes al soporte. En la última parte de esta tesis se propuso estudiar la influencia de la topografía y de la química, y determinar su contribución durante la adhesión y proliferación celular. Es de extrema importancia reconstruir las condiciones que las células encuentran en su ambiente natural, y solamente entendiendo ambos, la química y la topografía, es posible obtener un sistema óptimo para el desarrollo de un tejido. Con ese propósito fue creada una superficie con topografía controlada recubierta específicamente por un ELR con la secuencia RGD. Se utilizaron superficies con y sin el ELR bioactivo en los experimentos de adhesión celular, y se determinó la influencia y contribución del polímero y la topografía. El trabajo desarrollado a lo largo de la actual tesis pretende contribuir a la evolución del campo de los biomateriales planteando varios aspectos esenciales para la aplicación de un biomaterial. Empezando por la creación de nuevas herramientas moleculares que han permitido obtener varios ELRs con funcionalidades y usos específicos distintos; y terminando por los estudios que contribuyen a la mejor comprensión sobre el funcionamiento de un soporte polimérico en la ingeniería de tejidos.