Desarrollo de un modelo tridimensional de conjuntiva humana con matrices biocompatibles para el estudio de enfermedades inflamatorias

Zusammenfassung

En esta tesis doctoral se presenta un nuevo modelo tridimensional de conjuntiva humana. El desarrollo de un nuevo modelo es necesario para superar las limitaciones de los modelos in vitro disponibles y, permitir con ello, reducir el número de animales de experimentación que son usados en los ensayos in vivo sobre enfermedades inflamatorias de la superficie ocular. Para desarrollar este nuevo modelo, primero se elaboró un protocolo optimizado para cultivar células epiteliales y fibroblastos a partir de muestras de tejido conjuntival obtenido de donante cadáver. Además, se llevaron a cabo algunos experimentos para seleccionar un biomaterial que resultara adecuado para mantener viables a las células y que sirviera como andamio para el modelo tridimensional de conjuntiva. Las matrices de fibrina resultaron adecuadas para este propósito y fue el biomaterial escogido. Los fibroblastos se cultivaron en el interior de las matrices de fibrina y las células epiteliales encima. Dichas células epiteliales fueron capaces de estratificar, alcanzando 5-6 capas a los 14 días de cultivo sobre las matrices. Además, se observaron algunas células de tipo caliciforme. Una vez que el modelo tridimensional estuvo puesto a punto, se llevó a cabo una prueba de concepto para demostrar su utilidad para estudiar enfermedades inflamatorias de la superficie ocular. El modelo tridimensional fue expuesto a distintas condiciones, como el cultivo aireado, la desecación o el tratamiento con citoquinas. Después de la exposición a estas condiciones adversas, se analizaron los cambios producidos en el modelo, tanto los estructurales como en los marcadores celulares. Tanto las condiciones experimentales como los marcadores a analizar fueron seleccionados gracias al conocimiento adquirido en estudios de inflamación en los distintos tipos de células conjuntivales. En dichos estudios, se comprobó la implicación de los receptores de ácido hialurónico CD44 y RHAMM en enfermedades inflamatorias de la superficie ocular, y se analizó también el papel de varias citoquinas sobre las células caliciformes. Los resultados obtenidos en el modelo tridimensional fueron acordes a lo esperado teniendo en cuenta los datos obtenidos en pacientes con patologías oculares. Por ejemplo, cuando el modelo fue expuesto a IL-13, los niveles de secreción de MUC5AC aumentaron, tal y como ocurre en pacientes con conjuntivitis alérgica donde esta citoquina está elevada. Cuando el modelo se sometió a condiciones de desecación, se encontró un descenso en la expresión de RHAMM, al igual que ocurría en pacientes con síndrome de Sjögren o rosácea. Los resultados obtenidos en los distintos estudios que componen esta tesis indican que el nuevo modelo tridimensional desarrollado puede ser una herramienta útil para llevar a cabo estudios relacionados con la inflamación conjuntival.