Thermosensitive injectable hydrogels with enhanced stability based on elastin, silk and leucine zipper motifs for tissue engineering and drug delivery applications

Resumen

Los sistemas y entidades biológicos gozan de unas propiedades extraordinarias que han sido alcanzadas como consecuencia de miles de millones de años de evolución, durante los cuales la selección natural ha actuado como motor para el desarrollo de los mejores diseños funcionales. Siguiendo este conocimiento, tanto los polímeros biológicos como los organismos vivos han servido de modelos para el diseño de dispositivos dinámicos y multifuncionales. Además, estos componentes de sistemas naturales se pueden utilizar para propósitos distintos a los que cumplen en la naturaleza. Esta extrapolación requiere de un conocimiento profundo de las propiedades biofísicas de las estructuras moleculares implicadas. Los biopolímeros naturales en general, y los basados en proteínas en particular, constituyen un excelente ejemplo de cómo todas sus propiedades están directamente relacionadas con las propiedades fisicoquímicas de los monómeros que los constituyen y en el caso de las proteínas, por su secuencia, y constituyen por tanto una fuente atractiva para la creación de diseños bio-inspirados en el laboratorio. Además, la biotecnología nos proporciona las herramientas idóneas para copiar y adaptar los diseños de las maquinas biológicas para la creación de nuevas versiones que satisfagan completamente nuestros requerimientos. Teniendo en cuenta lo descrito, en este trabajo se pretende combinar en la misma molécula las propiedades específicas proporcionadas por distintos motivos naturales seleccionados, tales como dominios tipo cremallera de leucina, fibroína de la seda o elastina. Dicha combinación tiene como objetivo elucidar las interacciones entre los dominios tipo elastina y los dominios tipo cremallera de leucina y tipo fibroína respectivamente y crear en consecuencia nuevos materiales proteicos capaces de formar hidrogeles inyectables, con propiedades avanzadas y con alto potencial de aplicación en el ámbito biomédico. En el presente trabajo se recogen las principales etapas requeridas para la consecución de tal propósito; concretamente el diseño de genes, la bioproducción de los biomateriales en organismos modificados genéticamente, su purificación, la elucidación de las propiedades fisicoquímicas, el estudio de su citocompatibilidad y en algunos casos también el estudio de sus propiedades “in vivo”. En concreto, el primer capítulo se centra en el diseño y producción de un recombinámero basado en dominios peptídicos presentes en la fibroína de la seda y en la elastina, capaz de formar hidrogeles físicos inyectables, estables y nano-fibrilares en condiciones fisiológicas. Los experimentos de reología y de calorimetría diferencial de barrido mostraron que este sistema presenta un mecanismo de gelificación dual. En una primera etapa, se produce una gelificación rápida y reversible, desencadenada térmicamente cuando la solución del material alcanza la temperatura corporal. Dicha gelificación temprana es debida al bloque anfifílico bioinspirado en la elastina. Después de esta primera etapa, se desencadena la segunda, que se caracteriza por una estabilización y reforzamiento del gel, y su naturaleza irreversible. El análisis por FTIR mostró cómo este proceso está asociado a nivel molecular con la adopción de una conformación en hojas-β por parte de los dominios tipo seda, que lleva parejo a nivel nanométrico la organización del material en una estructura fibrosa, como se demostró por AFM y por TEM. El diseño de este material sienta las bases de la mínima estructura necesaria para proporcionar toda la batería de propiedades físicas descritas, siendo capaz de transformarse de un estado líquido a un estado de hidrogel fibroso. Dicha transformación es consecuencia del diseño molecular realizado, en el que tiene lugar una complementación “simbiótica” entre ambos dominios, permitiendo la consecución de un material inyectable que desemboca en un hidrogel con propiedades estructurales miméticas a las de la matriz extracelular, abordando por tanto un gran reto en el área de la ingeniería de tejidos. En definitiva, los resultados aquí presentados demuestran el potencial de este sistema como base para el desarrollo de biomateriales fibrilares inyectables, para la consecución final de una matriz extracelular biomimética y completamente funcional. El segundo capítulo se centra en el desarrollo de un recombinámero basado en dominios tipo “cremallera” de leucina y elastina con el fin de elucidar el comportamiento de dichos dominios cuando co-existen en la misma molécula, así como de crear hidrogeles inyectables estables y reversibles. Los estudios de reología llevados a cabo mostraron un efecto de cooperación positiva entre ambos tipos de dominios, sin que estén implicados cambios conformacionales en la disposición en hélice-α del motivo “cremallera” de leucina, como se demostró por dicroísmo circular. Los experimetos de AFM demostraron que los motivos “cremallera” de leucina inducían la agregación de las nanopartículas esféricas, lo que refuerza a nivel nanométrico el incremento en la estabilidad otorgado por el dominio “cremallera” a nivel macroscópico. Además, la citocompatibilidad demostrada por el material resultante lo convierte en un biomaterial con un alto potencial en aplicaciones biomédicas, y su naturaleza recombinante facilita la inclusión de secuencias bioactivas, tales como RGD. De esta manera, el presente capítulo también aborda la inclusión de esta secuencia por ingeniería genética, y la versión bioactiva resultante mostró un incremento en la capacidad adhesiva, como revelaron los experimentos de adhesión celular realizados. En el tercer capítulo, se explora la aplicación de los recombinámeros diseñados en el ámbito de la liberación de fármacos. El campo de los biomateriales complementa al área de la farmacología gracias a la aportación de plataformas desde las cuales el agente terapéutico puede ser liberado de una manera precisa, evitando perfiles de liberación con “picos y valles” que puedan acentuar el riesgo de efectos secundarios y prolongando el efecto terapéutico del agente activo. Desde la perspectiva industrial y de desarrollo de producto, el ajuste de los perfiles de liberación a modelos matemáticos ayuda a realizar una mejor evaluación de la cinética y del mecanismo de liberación. El conocimiento e interpretación de dichos parámetros constituye un punto clave a la hora de progresar en el diseño de nuevos sistemas de liberación de una manera racional. Teniendo esto en cuenta, la primera sección de este tercer capítulo se centra en el estudio de la influencia de las propiedades mecánicas inherentes a los hidrogeles desarrollados, en la cinética y mecanismo que gobierna la liberación de un fármaco proteico modelo (insulina). La segunda sección se centra en la incorporación de dos de los recombinámeros en el desarrollo de una formulación oftálmica contra el glaucoma. Los test in vivo de irritación, de adhesión y las medidas de presión intraocular mostraron un alto potencial en la utilización de estos sistemas como vehículos de liberación de fármacos en el área de la oftalmología.