Aplicación de estrategias basadas en la secuenciación de genomas para la activación de la producción de nuevos compuestos bioactivos en streptomyces sp

Abstract

En los últimos años, debido al aumento de las resistencias bacterianas a antibióticos y a la necesidad de compuestos antitumorales nuevos, más efectivos y específicos, sumado a la baja eficacia de los métodos de escrutinio tradicionales, se ha hecho necesario el desarrollo de nuevas estrategias para la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos. Los Actinomicetos son el grupo de bacterias más importante en la síntesis de compuestos bioactivos de origen microbiano, con un 5-10 % de su genoma dedicado al metabolismo secundario, y dentro de éstos, Streptomyces es el género de mayor peso, ya que supone un 75 % de la producción. La secuenciación de genomas ha puesto de manifiesto su potencial productor, ya que contienen un elevado número de agrupamientos génicos destinados al metabolismo secundario, superior al número de metabolitos detectados en condiciones experimentales. La minería genómica trata de descubrir nuevos compuestos utilizando estrategias bioinformáticas y de ingeniería genética para identificar o inducir la expresión de estos agrupamientos silenciosos o crípticos. Las halogenasas son enzimas de “decoración” que incorporan halógenos a gran variedad de compuestos generando diversidad de actividad y de estructuras. Además, el halógeno es importante para la biodisponibilidad y actividad biológica de estos compuestos, porque aumenta la estabilidad, efectividad y especificidad. Por tanto, el uso de genes que codifican halogenasas como marcadores de nuevos clústeres de interés es una estrategia interesante para la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos. En nuestro laboratorio se dispone de una colección de 30 cepas de Streptomyces sp. aisladas de hormigas de la tribu Atinni en la que se llevó a cabo una búsqueda de clústeres de interés utilizando como marcador genes de halogenasas. Para ello se utilizaron herramientas bioinformáticas y de minería genómica, tales como Blast (Basic Local Alignment Search Tool) y antiSMASH (antibiotics & secondary metabolite analysis shell), mediante las que se localizaron 6 genes codificantes de halogenasas en genomas secuenciados, 2 de ellos situados en clústeres biosintéticos. Además, mediante PCR utilizando oligonucleótidos degenerados dirigidos a motivos conservados para la amplificación de dominios conservados típicos de halogenasas FAD-dependientes se localizaron 5 genes codificantes de halogenasas. En algunos casos, únicamente utilizando el análisis bioinformático y de homologías mediante antiSMASH, BLAST y otras herramientas como MultiGeneBlast, se pudo constatar que el gen codificante de la halogenasa detectado estaba contenido en un clúster cuyo producto era ya conocido y correspondía con un compuesto halogenado. En otros casos, para el estudio de los clústeres de interés, se utilizaron diferentes herramientas de ingeniería genética (inactivación o sobreexpresión de genes biosintéticos estructurales, reguladores o halogenasas, expresión heteróloga), tras las cuales se analizó mediante UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography), HPLC-MS (High Performance Liquid Chromatography- Mass Spectrometry) y desreplicación la producción en diferentes medios de cultivo extraída con diferentes solventes químicos de las cepas obtenidas respecto a la cepa silvestre, para identificar los compuestos potencialmente halogenados producidos. En la cepa Streptomyces sp. CS147, se detectó una halogenasa FAD-dependiente de triptófano, en los análisis bioinformáticos y mediante PCR, que estaba situada en un clúster de biosíntesis de tipo NRPS-ladderane. La inactivación de esta NRPS llevó a la identificación de las cloratinomicinas, compuestos halogenados no presentes en el diccionario de productos naturales que fueron purificados para elucidar su estructura y evaluar su actividad biológica. Además, se realizaron mutantes en varios genes del clúster, para estudiar su posible ruta biosintética.