Caracterización molecular del reordenamiento de la cadena pesada de inmunoglobulinas en mieloma múltipleutilidad como marcador de enfermedad mínima residual

Résumé

La presente tesis doctoral tiene como objetivos caracterizar el reordenamiento de la cadena pesada de inmunoglobulinas (IGH) en mieloma múltiple, para posteriormente evaluar la presencia de enfermedad mínima residual (EMR) en muestras de seguimiento de estos pacientes mediante técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS). Los principales resultados obtenidos se han agrupado en 3 trabajos que han sido ya publicados en revistas indexadas. Trabajo 1: Introducción: Los síndromes linfoproliferativos B (SLP-B) y las gammapatías monoclonales están causados por la expansión de un clon tumoral en una fase específica de diferenciación de la célula B, que permanece reflejada en las características de las inmunoglobulinas (Igs) que secretan o expresan en su superficie. En la médula ósea (MO), los genes de Igs experimentan un reordenamiento altamente estructurado y jerarquizado que confiere a cada célula B la capacidad para reconocer un antígeno específico y diferente al del resto de células, principalmente mediante la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3), única para cada célula. Esta elevada afinidad por un único antígeno aumenta aún más en el centro germinal de los órganos linfoides secundarios gracias a los fenómenos de hipermutación somática (SHM) y cambio de isotipo (CSR). Aunque el origen concreto del mieloma múltiple (MM) es aún controvertido, clínicamente se manifiesta cuando una célula plasmática (CP) se expande en la MO, tras la reacción del centro germinal. El uso de los genes de Igs, la tasa de SHM o la estructura de la región variable de Igs han sido estudiados en MM previamente, aunque generalmente en series pequeñas, heterogéneas y sin asociación clínico-pronóstica. Pacientes y métodos: se evaluaron 413 pacientes con MM diagnosticados entre 1995 y 2016. Los reordenamientos clonales VDJ de la cadena pesada de inmunoglobulinas (IGH) fueron caracterizados mediante secuenciación Sanger empleando los primers FR1 del grupo Euroclonality (antes BIOMED-2). Además, se empleó secuenciación de nueva generación (NGS) utilizando el kit IGH FR1 de LymphoTrack (Invivoscribe, Inc. San Diego, CA, USA) en 113 casos. La composición de reordenamientos clonales y la tasa de SHM se analizó con el software IGMT/V-QUEST. El software LymphoTrackAnalysis v1.0 de Invivoscribe se empleó para el análisis bioinformático de los datos obtenidos por NGS. La presencia de Igs estereotipadas se evaluó con el software ClustalX2.0. Para el análisis estadístico integrado de variables clínicas y moleculares se utilizó el programa SPSS v23.0. Resultados: Se detectaron reordenamientos clonales completos en 382/413 casos (92.5%). Se encontró un uso sesgado de genes IGHV, con predominio de genes IGHV3 (52.7%), como IGHV3-30 (12.7%), IGHV3-33 (5.2%) o IGHV3-23 (5%). De igual forma, entre los genes IGHD, IGHD2 (25.4%) e IGHD3 (30.4%) fueron los más frecuentemente utilizados, así como IGHJ4 (46.4%) y IGHJ6 (25%) entre los genes IGHJ. En general, se identificó una elevada tasa de SHM en la serie de pacientes (mediana: 8.8% de desviación respecto a la línea germinal), aunque con diferencias significativas en función del estadio madurativo de las CP y del uso de genes IGHV: la mediana de SHM en pacientes que usaban genes IGHV2 fue inferior en comparación a la encontrada en pacientes que utilizaban genes IGHV1, IGHV3 o IGHV4. El análisis de CDR3 reveló una longitud media de 15 aminoácidos con una composición rica en glicina, alanina, ácido aspártico y tirosina. El análisis de clusters descartó la presencia de receptores estereotipados en esta serie de pacientes. Por último, se observó que ciertas características moleculares se correlacionaban con la clínica del paciente no candidato a trasplante autólogo (TASPE): en el análisis multivariante, el uso de genes IGHD2/IGHD3 se asoció con un menor riesgo de progresión (Hazard ratio: 0.552, 95% IC: 0.361—0.845, p = 0.012), mientras que una tasa de SHM ≥ 7% se asoció a un menor riesgo de muerte (Hazard ratio: 0.291, 95% IC: 0.137—0.618, p = 0.001). Discusión y conclusiones: El presente estudio revela la composición particular del repertorio VDJ del reordenamiento IGH en MM, diferente al de CP sanas y con un sesgo en el uso de genes menor al de otros SLP-B. En cambio, la composición del CDR3 reveló una gran similitud con el repertorio de Igs de CP normales, aunque es completamente distinto al de ciertos SLP-B, lo que explica la ausencia de receptores estereotipados en MM. En conjunto, estos resultados sugieren una participación limitada de antígenos concretos en la expansión de los clones patológicos. De manera novedosa, se establece por primera vez relación entre algunas de las características moleculares del reordenamiento (tasa de SHM y uso de genes IGHD) y la supervivencia del paciente no candidato a TASPE, que podrían convertirse en nuevos biomarcadores de riesgo al diagnóstico. Trabajo 2: Introducción: La enfermedad mínima residual (EMR) hace referencia a la presencia de una pequeña fracción de células tumorales tras el tratamiento, indetectables mediante las técnicas convencionales, y que son responsables de las recaídas de la enfermedad. La presencia de EMR es actualmente uno de los parámetros más informativos para el paciente con mieloma múltiple (MM), dado que aquellos pacientes con EMR indetectable muestran una supervivencia mayor que aquellos pacientes en los que sí se detecta EMR. Actualmente, el grupo internacional de mieloma (IMWG) recomienda el empleo de la citometría de flujo de nueva generación (NGF) desarrollada por el grupo EuroFlow o la secuenciación de nueva generación (NGS) empleando la estrategia de ClonoSEQ (Adaptive Biotechnologies) para la detección de EMR. Validar nuevas estrategias permitiría ampliar las opciones disponibles para el estudio de EMR y aportaría ventajas adicionales. Pacientes y métodos: Se realizó una validación técnica preliminar del panel comercial de LymphoTrack (Invivoscribe, Inc. San Diego, CA, USA) mediante un estudio de diluciones seriadas con muestras de células CD138+ seleccionadas de la médula ósea (MO) de 20 pacientes con MM, con el objetivo de establecer la sensibilidad y el límite de cuantificación. Posteriormente, se utilizaron 202 muestras pareadas de MO, obtenidas de 101 pacientes con MM al diagnóstico y en un momento temprano de su seguimiento (final de inducción o día 100 post trasplante autólogo), que fueron analizadas en dos centros diferentes para determinar la reproducibilidad de los resultados y comparar técnicas. Las muestras de diagnóstico fueron evaluadas mediante secuenciación Sanger empleando los primers del grupo Euroclonality en un centro, y mediante NGS utilizando el panel comercial de LymphoTrack en el segundo centro. Las muestras de seguimiento se analizaron por NGS con el mismo panel comercial en ambos centros, añadiendo una cantidad preestablecida de ADN procedente de una línea celular a modo de spike in para la cuantificación absoluta de EMR, además de por NGF en uno de los centros. Para el análisis de resultados se utilizaron los softwares IMGT/V-QUEST, LymphoTrackAnalysis v1.0 e INFINICYT v2.0. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS v23.0. Resultados: La sensibilidad analítica y el límite de cuantificación máximos de la estrategia de NGS quedaron establecidos en 4·10-6 y 3·10-5 respectivamente, empleando 2 µg de ADN. La aplicabilidad de las técnicas de Sanger y NGS para la detección del reordenamiento clonotípico fue similar, 99% y 100% respectivamente. La concordancia entre las dos técnicas fue elevada, con un 97.9% de clonotipos coincidentes. El estudio paralelo de EMR por NGS fue posible en 82 casos, con una reproducibilidad inter-laboratorio del 85.4%, una correlación elevada (R2 = 0.869) y una mediana de sensibilidad de 10-5. Al comparar los resultados de NGS obtenidos en ambos centros con la NGF, se mantuvo una elevada correlación (R2 > 0.800 en todos los casos), a pesar de que el análisis por NGF alcanzó sensibilidades superiores a la NGS, de hasta 2·10-6, debido al empleo de aproximadamente 100 veces más cantidad de células totales para el análisis. A pesar de ello, la utilidad clínica de NGS y NGF fue similar cuando se valoró la supervivencia de los casos en los que se logró alcanzar una sensibilidad mínima de 10-5 con ambas técnicas. El método de Bland-Altman permitió demostrar la ausencia de un sesgo significativo entre los resultados conseguidos con ambas técnicas. Discusión y conclusiones: Los resultados obtenidos en el presente trabajo apoyan la utilización del panel de LymphoTrack para la detección de clonalidad en MM, con una aplicabilidad muy elevada y resultados comparables a la secuenciación Sanger, con la ventaja adicional de que las técnicas de NGS permiten analizar muestras con niveles de infiltración muy reducidos o fondo B policlonal elevado, características habituales en las muestras de MM que generalmente impiden emplear la secuenciación convencional. Por otro lado, aunque con NGF se alcanzó una sensibilidad superior a la conseguida con NGS, la capacidad para detectar EMR fue similar para ambas técnicas. En conclusión, la estrategia alternativa de NGS evaluada en este estudio es útil para la identificación del reordenamiento clonotípico al diagnóstico y la detección de EMR, con resultados comparables a las técnicas estándar. Trabajo 3: Introducción: La supervivencia de los pacientes con mieloma múltiple (MM) ha experimentado una notable mejoría en los últimos 20 años con la introducción de nuevos agentes farmacológicos que han incrementado la proporción de pacientes que alcanzan respuesta completa (RC). A pesar de ello, incluso aquellos pacientes con respuestas óptimas continúan recayendo debido a la presencia de células tumorales residuales (enfermedad mínima residual, EMR), detectables únicamente mediante nuevas tecnologías de alta sensibilidad. Únicamente dos de estas estrategias han sido validadas por el grupo internacional de mieloma (IMWG): la estrategia de citometría de flujo de nueva generación (NGF) desarrollada por el grupo EuroFlow, y la estrategia de secuenciación de nueva generación (NGS) de Adaptive Biotechnologies, ClonoSEQ. Aunque los resultados de varios estudios indican que ambos métodos son equivalentes, no se ha realizado hasta la fecha una comparación directa entre ambos tipos de técnicas. Pacientes y métodos: En el presente estudio se incluyeron 106 pacientes con MM de nuevo diagnóstico candidatos a trasplante autólogo (TASPE), tratados dentro del ensayo clínico GEM2012MENOS65. En esta serie de pacientes se utilizó ADN extraído de biopsias de médula ósea (MO) obtenidas en el día 100 post TASPE para cuantificar la EMR mediante la estrategia de NGS de LymphoTrack (mediana de sensibilidad 10-5), añadiendo una cantidad preestablecida de ADN procedente de una línea celular a modo de spike in para la cuantificación absoluta de EMR. Estos resultados fueron comparados con los obtenidos mediante NGF (mediana de sensibilidad 2·10-6). Además, los datos de EMR se integraron con datos clínicos, incluyendo otros marcadores pronósticos (citogenética basal y respuesta serológica). Para el análisis de resultados se utilizaron los softwares LymphoTrackAnalysis v1.0 e INFINICYT v2.0. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS v23.0. Resultados: La proporción de pacientes con EMR indetectable por NGS y NGF fue de un 50% y un 54.7%, respectivamente. Los resultados obtenidos por ambas técnicas fueron altamente concordantes (R2 = 0.905) con un total de 15 casos discordantes (N = 5 casos NGF+/NGS−; N = 10 casos NGF−/NGS+), sin sesgos significativos entre ambas técnicas (media de las diferencias: 0.06, 95% IC: 0.12/-0.01; p > 0.05). Clínicamente, la ausencia de EMR detectable tuvo un impacto significativo en la supervivencia libre de progresión (SLP) a 3 años respecto a aquellos pacientes con EMR detectable: 88.7% vs. 56.6% mediante NGS, 91.4% vs. 50% mediante NGF (p < 0.001 en ambos casos). De forma similar, la supervivencia global (SG) también fue significativamente superior para pacientes con EMR indetectable (96.2%) frente a la de pacientes con EMR positiva (74.9%) sin importar la técnica elegida (p < 0.01 en ambos casos). Además, se constató que la ausencia de EMR revierte el mal pronóstico de la citogenética, con tasas de SLP y SG similares a las de pacientes sin citogenética adversa. En el análisis multivariante, tanto la NGS como la NGF demostraron un poder predictivo similar: tanto la EMR detectada por NGF (HR: 0.16, 95% CI: 0.07–0.37, p < 0.001) como el ISS revisado (HR: 0.30, 95% CI: 0.12–0.72, p = 0.007) aparecieron como factores pronósticos independientes de SLP, mientras que la EMR detectada por NGS (HR: 0.15, 95% CI: 0.04–0.57, p = 0.005) y el ISS revisado (HR: 0.13, 95% CI: 0.04–0.39, p < 0.001) aparecieron como factores pronósticos independientes de SG. Discusión y conclusiones: El presente estudio revela el potencial predictivo de la detección de EMR mediante técnicas de nueva generación. Tanto la NGS como la NGF tienen una capacidad similar para definir el pronóstico del paciente, muy superior a la de las técnicas serológicas de evaluación de la respuesta. Nuestros datos sugieren que la ausencia de EMR se asocia de manera muy significativa con una prolongación de la SLP y de la SG, además de que puede revertir el pronóstico adverso de la citogenética de alto riesgo. En conclusión, ambas metodologías son óptimas para la estratificación del riesgo de los pacientes con MM, y pueden emplearse indistintamente, por lo que podrían incorporarse en un futuro cercano para la evaluación de la respuesta al tratamiento en pacientes fuera de ensayo clínico.