Nuevos avances en la quimioterapia y el intercambio genético en Leishmania

Zusammenfassung

Los parásitos pertenecientes al género Leishmania presentan un ciclo de vida con dos hospedadores, por un lado, vectores de los géneros Phlebotomus y Lutzomyia y por otro, mamíferos que sirven como hospedador definitivo y reservorios. Estos protozoos son los causantes de un grupo de enfermedades denominadas leishmaniasis, englobadas por la Organización Mundial de la Salud dentro de las denominadas enfermedades tropicales desatendidas, ya que afectan en mayor medida a países con pocos recursos económicos. Las leishmaniasis se dividen en dos tipos principales en función de las manifestaciones clíncias: la leishmaniasis visceral o kala-azar, causada por especies como Leishmania infantum o L. donovani, es mortal sin tratamiento y su característica principal es la inflamación del hígado y el bazo, nichos principales del parásito. La leishmaniasis cutánea es producida por especies como L. major o L. tropica, se caracteriza por la aparición de lesiones en la piel, o en la piel y mucosa en el caso de la variante de leishmaniasis mucocutánea, siendo en este caso las causantes las especies del complejo L. braziliensis, de peor pronóstico sin tratamiento. El manejo de la enfermedad, dadas las limitaciones que tienen medidas como el control de reservorios y vectores, y debido a que no se ha desarrollado ninguna vacuna eficaz en humanos, se ha basado en la quimioterapia, dentro de la cual se destacan fármacos como los antimoniales pentavalentes, la anfotericina B, la miltefosina o la paromomicina, entre otros. Sin embargo, las terapias utilizadas presentan inconvenientes, como efectos secundarios, necesidad de hospitalización, aumento de cepas resistentes, precio elevado, etc. Esta situación apremia el descubrimiento de nuevos fármacos y la inversión en el desarrollo de nuevas estrategias para hacer frente a Leishmania. Entre las estrategias utilizadas, en esta Memoria nos hemos centrado en dos: el uso de dianas terapéuticas para evaluar potenciales tratamientos frente a Leishmania, en concreto, las ADN topoisomerasas, y la vehiculización de fármacos para la liberación controlada de los mismos en el interior de la vacuola parasitófora en la que se localiza el parásito. El cribado dirigido en el descubrimiento de fármacos se basa en la identificación de compuestos activos específicamente frente a dianas del parásito, respetando las estructuras homólogas del hospedador. Las ADN topoisomerasas son enzimas con funciones importantes en los procesos de replicación, transcripción, reparación y recombinación del ADN, y debido a las diferencias estructurales que presentan respecto a las enzimas homólogas humanas, son buenas dianas terapéuticas. Por ejemplo, la topoisomerasa IB de Leishmania es heterodimérica, lo que contrarresta con el resto de TopIB descritas, que son monoméricas. Esta enzima es la encargada de relajar las tensiones de torsión en el ADN, para lo cual escinde una hebra de la cadena nucleotídica uniéndose al ADN y formando un complejo de escisión enzima-ADN transitorio, sin embargo, en el proceso, algunos inhibidores de la enzima pueden unirse a este complejo transitorio, estabilizándolo y dando lugar a roturas de doble cadena cuando la horquilla de replicación choca contra el complejo enzima-ADN-inhibidor. Una de las señales tempranas de daño de doble cadena en las células eucariotas es la fosforilación de la histona H2A, por lo que la medida de fosforilación podría indicar la capacidad de algunos compuestos para inhibir al parásito, que junto con otros datos nos da información sobre potenciales fármacos leishmanicidas. En el Capítulo 1 de esta Memoria se ha estudiado la fosforilación de la histona H2A de Leishmania como señal temprana de daño de doble cadena para evaluar la capacidad leishmanicida de compuestos inhibidores de la Topoisomerasa I del parásito, en concreto, una serie de 20 compuestos indenoisoquinolínicos con distintos sustituyentes en las posiciones N6, C3, C8 y C9, testados frente a promastigotes y amastigotes esplénicos obtenidos de infecciones experimentales de ratón, y se evaluó la capacidad de estabilización del complejo de rotura enzima-ADN, la fosforilación de la histona H2A como señal temprana de daño de doble cadena y la fragmentación de ADN que eran capaces de provocar. El efecto leishmanicida de la mayor parte de los compuestos analizados estuvo en el rango micromolar o submicromolar, y la mayor capacidad de inhibición del parásito se observó en los compuestos con un átomo de N en el anillo de indenoisoquinolina (7-azaindenoisoquinolinas), que además inhibieron en gran medida la topoisomerasa IB y produjeron fosforilación de la histona H2A. La vehiculización de fármacos es otra de las aproximaciones destacada en la mejora de los tratamientos actuales frente a la leishmaniasis. La nanotecnología engloba el uso de nanoestructuras que pueden llegar a varios cientos de nm y que permite dirigir fármacos a los órganos o células de interés. En el caso de Leishmania, el fármaco puede ser dirigido a la vacuola parasitófora en la que se encuentra el parásito en el interior de los macrófagos infectados, disminuyendo la toxicidad del compuesto, protegiendo al fármaco de la degradación y facilitando la solubilización del mismo. Existen numerosos tipos de nanopartículas, entre las que se encuentran los dendrímeros. En el capítulo 2 de esta Memoria se ha evaluado un conjugado de poliglicerol dendrítico (PG-PEG) que presenta doxorubicina unida mediante un enlace hidrazona sensible a pH, lo que podría permitir la liberación de la droga en ambientes ácidos, como el fagolisosoma. La citotoxicidad del conjugado se evaluó utilizando dos líneas tumorales de macrófagos murinos y esplenocitos procedentes de ratones Balb/c, y el efecto leishmanicida se obtuvo utilizando promastigotes y amastigotes intracelulares. El conjugado PG-DOX(pH)-PEG fue capaz de liberar el fármaco en el interior de las vacuolas parasitóforas de Leishmania, disminuyó la toxicidad respecto a la doxorubicina libre al evitar la acumulación del fármaco en los núcleos celulares del macrófago y co-localizó con los lisosomas de la célula y posteriormente con los amastigotes de Leishmania en las vacuolas parasitóforas. Paralelamente al empleo y la búsqueda de nuevas aproximaciones que permitan la mejora de los fármacos actualmente utilizados o el desarrollo de nuevos compuestos con mejores perfiles de toxicidad y eficacia, el avance en el estudio de aspectos básicos de la biología del parásito, como la reproducción, resulta fundamental para comprender los procesos que han permitido a estas especies evolucionar y adaptarse a nuevos ambientes, lo que incluye la adquisición de características ventajosas para el parásito (como la resistencia a fármacos o el aumento de la virulencia). Uno de los mayores enigmas a los que se ha enfrentado la biología evolutiva es determinar cuáles son las causas que permiten el mantenimiento del sexo de forma casi universal en las especies eucariotas, pese a sus costes. Multitud de hipótesis, como la hipótesis de la reina roja (sobre la co-evolución parásito-hospedador), el modelo de la lotería (que explica la reproducción sexual como un aumento de posibilidades frente a un ambiente al que adaptarse) o el sexo como forma de purgar mutaciones deletéreas (interferencia de Hill-Robertson y trinquete de Muller), trataron de explicar los motivos que llevan a la aparición, y sobre todo el mantenimiento de la reproducción sexual. Finalmente, parece que un enfoque pluralista, es decir, un conjunto de factores y no uno único, es el mejor modelo que permite abordar y entender esta cuestión. Durante muchos años, se consideró que los tripanosomátidos y otros eucariotas unicelulares se reproducían de una forma exclusivamente asexual, debido a la ausencia de recombinación y segregación en las poblaciones, a la baja detección de genotipos recombinantes, a la desviación del equilibro Hardy-Weinberg detectada y en general, debido a la estabilidad genómica que presentaban estas especies. Sin embargo, estudios isoenzimáticos y el descubrimiento de híbridos naturales en poblaciones de Leishmania y Trypanosoma fueron aportando pruebas que indicaban que existía intercambio genético en estas especies, y a partir de finales de la década de los 80, los cruces experimentales obtenidos en el laboratorio en Trypanosoma y posteriormente entre especies de Leishmania, han ido aumentando el conocimiento sobre la reproducción sexual de estos parásitos, que en general no es una parte obligatoria del ciclo biológico pero que seguramente ha tenido consecuencias importantes a nivel evolutivo y en la adquisición de características ventajosas. En el capítulo 3, se han obtenido híbridos intraclonales e interespecies utilizando líneas parentales de L. major, L. tropica y L. donovani, modificadas para expresar genes que codifican proteínas fluorescentes rojas (mCherry), verdes (citrina) o infrarrojas (iRFP). Los híbridos obtenidos se han analizado genotípica y fenotípicamente, demostrando que respecto al genoma nuclear son híbridos completos, con una ploidía superior a las células parentales, y el estudio fenotípico ha mostrado fenotipos intermedios en cuanto a la capacidad infectiva y la capacidad de crecimiento en cultivo. Respecto a la herencia extranuclear, los maxicírculos del ADNk presentaron una herencia uniparental, al contrario que los minicírculos, en los que se observan mezclas de ambos parentales.