Diagnóstico de clonalidad de los síndromes linfoproliferativos crónicos de células t y nk

Abstract

Los síndromes linfoproliferativos crónicos T y NK (SLPC-T/NK) son neoplasias poco frecuentes derivadas de células T o NK maduras, cuyo diagnóstico sigue siendo un reto en el momento actual desde las etapas iniciales de rastreo de clonalidad, hasta su clasificación en categorías diagnósticas/pronósticas. La dificultad en el diagnóstico de clonalidad T/NK es debida, entre otros motivos, a la falta de ensayos rápidos, sencillos y reproducibles para la detección de clonalidad en células T y NK en los laboratorios clínicos. Si bien se dispone desde hace tiempo de métodos para evaluar la naturaleza clonal de poblaciones linfoides T sospechosas y de poblaciones linfoides NK sospechosas, estas técnicas presentan una serie de limitaciones para su implementación en la rutina de los laboratorios de diagnóstico. El diagnóstico de clonalidad de las leucemias de linfocitos grandes granulares (LLGG), un tipo de SLPC-T/NK caracterizado por la presencia de linfocitos grandes granulares (LGG) clonales en sangre, es aún más difícil mediante análisis inmunofenotípico e incluso molecular en muchos casos, debido a las semejanzas fenotípicas y moleculares entre los LGG clonales y las células normales de las que derivan (células citotóxicas efectoras terminales, generalmente activadas. Por otro lado, tampoco se dispone de marcadores pronósticos que predigan la evolución de estas leucemias de LGG, habitualmente indolentes, pero que en algunos casos presentan un curso más agresivo debido a la presencia de citopenias y otras complicaciones autoinmunes asociadas a los SLPC de LGG, o más raramente incluso pueden evolucionar a leucemias más agresivas. Recientemente, ha empezado a utilizarse en CMF un anticuerpo monoclonal contra la proteína de membrana codificada por uno de los dos genes constantes de la cadena β del TCR (en concreto, frente a TRBC1) como marcador de clonalidad T; los resultados preliminares acerca de su validez son prometedores, tanto en el estudio inicial como para la identificación de células tumorales tras tratamiento. A pesar de ello, hasta la fecha no se ha optimizado el procedimiento para su implementación rutinaria en laboratorios de diagnóstico, ni se han establecido de forma homogénea entre los distintos estudios los rangos de referencia de la normalidad de los patrones de expresión de TRBC1 en células Tαβ policlonales tanto normales como reactivas y sus subpoblaciones; además, falta por establecer los rangos de expresión de TRBC1 en las células Tαβ normales en función de su grado de maduración, lo cual resulta esencial si tenemos en cuenta que los diferentes SLPC-T muestran características típicas de ciertos estadios madurativos normales. Asimismo, aún no se ha validado la especificidad y la sensibilidad analítica del ensayo por CMF para la detección de células Tαβ clonales presentes en muy baja frecuencia, ni se ha realizado una comparación sistemática en series amplias de pacientes con el patrón oro de detección de clonalidad T. La disponibilidad de un test sencillo, rápido y reproducible, a la vez que específico y sensible, para su utilización mediante CMF ante la presencia de células Tαβ expandidas sospechosas de ser clonales sería de gran utilidad para la confirmación de clonalidad T, tanto en la fase de rastreo diagnóstico (de forma similar al empleo en el panel de rastreo de SLPC-B de anticuerpos que identifican células B maduras clonales a través de la demostración de restricción de cadena kappa o lambda), como en la detección de niveles bajos de enfermedad, ya sea tras tratamiento de la neoplasia (para valorar la respuesta terapéutica) o en el estudio de extensión de un SLPC-Tαβ. Por otro lado, hace ya casi 10 años de la primera descripción de la presencia de mutaciones somáticas en los genes STAT3 y STAT5B en un subgrupo de LLGG-T/NK; pese a ello, aún hoy se desconoce en gran medida la utilidad de este hallazgo como marcador de clonalidad de uso rutinario en el diagnóstico de las LGGL-T y SLPC-NK (especialmente en las expansiones de LGG diferentes a las TCD8); asimismo, queda por determinar de forma fehaciente el impacto pronóstico de la presencia de mutaciones somáticas de STAT3 y STAT5B en estos procesos; si bien la mayoría de los trabajos apuntan a la existencia de una asociación entre la presencia de mutaciones en los genes STAT3 y STAT5B y una mayor frecuencia de neutropenia, especialmente en pacientes con LLGG-TCD8+. Hasta el momento de comenzar este trabajo los resultados de los diferentes estudios no eran definitivos, ni se había referido una asociación fehaciente con la evolución de los diferentes tipos de LLGG. Ante estos antecedentes, en el presente trabajo de tesis doctoral nos planteamos como objetivo general mejorar las estrategias de diagnóstico de clonalidad de los distintos SLPC-T/NK, y de evaluación pronóstica en el caso particular de las LLGG, para su implementación rutinaria en un contexto clínico (es decir, fácil de implementar, reproducible, sensible y específico). Para ello, nos planteamos tres objetivos específicos: 1.- Optimizar y validar el ensayo de CMF con el anticuerpo anti-TRBC1 para la detección de células clonales Tαβ, mediante: 1a) la estandarización del protocolo de marcaje de TRBC1; 1b) la definición del patrón de expresión de TRBC1 de las células Tαβ normales totales y de las principales subpoblaciones T, como referencia de la normalidad, incluyendo el análisis por familias TCRVβ y por estadio madurativo T; y 1c) la evaluación de la sensibilidad y especificidad analítica de la técnica. 2.- Validar la utilidad del ensayo (ya optimizado) de CMF con el anticuerpo anti-TRBC1 en la detección de clonalidad Tαβ en el caso particular de las expansiones de linfocitos grandes granulares. 3.- Evaluar la frecuencia y tipo de mutaciones en los genes STAT3 y STAT5B en todos los subtipos de LLGG-T/SLPC-NK, con la finalidad de establecer su utilidad diagnóstica (incluido el diagnóstico de clonalidad T y, sobre todo, NK) y valorar su impacto pronóstico, a través de la asociación de la presencia de estas mutaciones con las características biológicas y clínicas de la enfermedad, y la evolución de los pacientes.