Análisis del desarrollo y de factores de virulencia y el efecto del NO en la germinación y el ciclo celular en Botrytis cinerea

Abstract

El óxido nítrico es una molécula señalizadora con funciones importantes y variadas en los distintos grupos taxonómicos, incluyendo a los hongos. En este reino, la molécula ha sido pobremente estudiada, pero se sabe que desempeña una vasta función señalizadora que abarca desde la modulación del desarrollo sexual y asexual y del metabolismo secundario hasta la colonización e infección de la planta hospedadora. Debido a estas múltiples funciones y su tiempo de vida corto, de unos pocos segundos, se hace fundamental la presencia de un balance que mantenga una concentración adecuada de NO en cada estado del ciclo de vida del hongo a través tanto de las reacciones de biosíntesis de la molécula como de sus mecanismos de detoxificación (Cánovas et al., 2016). Hasta el momento, dos vías de síntesis de NO han sido identificadas en hongos. La ruta oxidativa implicaría la presencia de una vía similar a la ruta oxidativa presente en mamíferos en la que la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) cataliza la conversión de L-arginina a L-citrulina produciendo óxido nítrico. Sin embargo, se trata de una ruta poco caracterizada debido a la ausencia de proteínas similares a la NOS (NOSLs) en los genomas fúngicos (Li et al., 2010; Samalova et al., 2013). La otra ruta es la ruta reductora, que requiere la acción sinérgica de la enzima nitrato reductasa para convertir el nitrato a nitrito y de la enzima nitrito reductasa que media la conversión de nitrito a NO y se considera que es la fuente enzimática de NO más importante en hongos (Horchani et al., 2011; Zhao et al., 2020). Los mecanismos catabólicos del NO están destinados a combatir la toxicidad de la molécula cuando alcanza altas concentraciones en las células, lo que puede desencadenar estrés nitrosativo (Brown and Borutaite, 2006; Fitzpatrick and Kim, 2015; Marroquin-Guzman et al., 2017). Estos mecanismos se basan principalmente en reacciones de oxidorreducción del NO o de sus formas derivadas, y entre ellos destacan las flavohemoglobinas que constituyen el mecanismo de desintoxicación inducible del NO mejor descrito en modelos fúngicos (Forrester and Foster, 2012). Estas enzimas son globinas quiméricas formadas por un dominio globina N-terminal y un dominio adyacente con actividad redox y de posición C-terminal. Su función se describe como NO dioxigenasas que requieren NADPH, FAD y O2 para convertir NO en {\rm NO}_3^- (Hausladen et al., 1998; Gardner et al., 1998). Botrytis cinerea es un hongo patógeno necrotrófico vegetal que infecta a más de 200 especies de cultivos, causando la enfermedad del moho gris con grandes pérdidas de producción agronómica en todo el mundo. El hongo tiene un solo gen, Bcfhg1, que codifica una flavohemoglobina funcional de la cual se ha sugerido que podría estar más relacionada con la modulación de los niveles de NO endógeno producidos por el hongo durante etapas específicas del desarrollo que con la protección del hongo contra niveles tóxicos de la molécula (Turrion-Gomez et al., 2010; Turrion-Gomez et al., 2011). En este sentido, con la intención de caracterizar los procesos fisiológicos en los que el metabolismo del NO es relevante en el hongo, nuestro grupo de investigación realizó un análisis de un experimento de microarray de perfiles de expresión génica en respuesta a fármacos moduladores de los niveles de NO en esporas de la cepa silvestre B05.10 y de ΔBcfhg1, cepa mutante defectuosa en el gen Bcfhg1 (Daniela Santander, Tesis Doctoral. Universidad de Salamanca). Este análisis permitió identificar, en el caso de la cepa mutante, que las categorías funcionales "ciclo celular", "síntesis de ADN" y "actividad nucleolo" fueron reprimidas por la acción de la molécula. Más específicamente, los genes con mayor nivel de represión fueron los ortólogos de los genes mcm (2-7) de S. cerevisiae, genes cuyos productos génicos conforman un complejo proteico esencial para la formación de los orígenes de la replicación y para la iniciación. de síntesis de ADN (Lei y Tye, 2001) y que se expresan entre la fase M y la fase G1 del ciclo celular (Enserink y Kolodner, 2010). La expresión de este grupo de genes está controlada por el factor de transcripción mcm1. También se encontró una fuerte represión de genes que se expresan específicamente en la fase G1. En esta levadura, la expresión de genes específicos de G1 está controlada por los complejos MBF, un factor de transcripción compuesto por mbp1 y swi6, y SBF, un factor de transcripción compuesto por swi4 y swi6. MBF controla preferentemente la expresión de genes relacionados con la replicación y reparación del ADN, mientras que SBF regula la expresión de genes implicados en el progreso del ciclo celular, la morfogénesis celular y la duplicación del cuerpo polar del huso (Enserink y Kolodner, 2010). También se reprimió el ortólogo del gen que codifica la enzima fosfatasa CDC25 de S. pombe. cdc25 participa en la activación de cdk1 (cdc2 en S. pombe) por desfosforilación. Esta última es una enzima clave en la regulación del ciclo celular ya que controla la entrada de la célula a la fase de mitosis desde la fase G2. Otros genes que se expresaron diferencialmente en este análisis, pero en B05.10 fueron Bcmed y Bcorp1. El primero es un factor regulador transcripcional que fue diferencialmente inducido cuando las esporas se cultivaron en presencia del secuestrador de NO, c-PTIO. El segundo codifica para una proteína hipotética y se indujo cuando el hongo se expuso al NO. En este contexto, en el presente trabajo nos propusimos analizar la función de varios de los genes antes mencionados como codificadores de proteínas reguladoras del ciclo celular y posibles dianas de óxido nítrico. Además, se consideró la caracterización funcional de los genes Bcmed y Bcorp1. El capítulo I describe en primer lugar el efecto modulador que tiene el NO sobre el desarrollo asexual de B. cinerea. Se realizaron ensayos de germinación en las que se incubaron esporas de las cepas B05.10 y ΔBcfhg1 del hongo en presencia de los fármacos DETA, un donador de NO, c-PTIO, un secuestrador de NO, y L-NNA, un inhibidor de la actividad óxido nítrico sintasa de mamíferos, en diferentes tiempos de muestreo. Los recuentos, estimaciones y tinciones con el colorante DAPI realizados en los cultivos determinaron que el NO tiene un efecto regulador negativo inmediato pero transitorio sobre la germinación, la elongación del tubo germinativo y la tasa de división nuclear del hongo. La flavohemoglobina BcFHG1 se presenta como una proteína con una potente función protectora frente a estos efectos. La inmediatez y transitoriedad observada en la acción del NO sugiere una rápida acción de señalización por parte de la molécula y nos condujo a plantear la hipótesis de que, en las condiciones evaluadas, el NO estaría afectando a la actividad de componentes esenciales para el progreso del ciclo celular a través de la modificación covalente de residuos de cisteína (S-nitrosilación) y de tirosina (nitración de tirosina). En concreto, propusimos que la molécula afectaría a las proteínas codificadas por los genes mbp1, swi4, swi6, cdc2, cdc25 y mcm1. Esta lista se completó con la inclusión del gen que codifica para la enzima nitrato reductasa, niaD. Esta proteína juega un papel relevante en la homeostasis del NO ya que participa en la síntesis reductora de la molécula y en su regulación durante el desarrollo fúngico (Cánovas et al., 2016). Además, se ha descrito in silico una posible S-nitrosilación de los residuos de cisteína en la superficie de esta proteína en plantas (Fu et al., 2018). Posteriormente, estas proteínas fueron sometidas a un análisis que tuvo como objetivo determinar la posible alteración de su actividad debido a modificaciones postraduccionales provocadas por la acción de la molécula. Una vez que los genes homólogos seleccionados en S. cerevisiae y S. pombe se identificaron en el genoma de B. cinerea, se llevó a cabo la construcción de una fusión traduccional en la que la secuencia del gen que codifica la proteína GFP fue fusionada al extremo C-terminal de la proteína codificada por cada uno de los genes de interés utilizando la tecnología Gateway (Invitrogen). Se obtuvieron varias cepas transformantes para cada proteína fusión, pero la evaluación de los niveles de S-nitrosilación y/o nitración de estas no fue posible debido a la incapacidad para purificarlas a partir de extractos de proteínas totales. Por otro lado, para obtener información sobre los factores y procesos fisiológicos que median la respuesta al NO previamente observada en las esporas en germinación y que pueden verse afectados por la función desintoxicante del NO de una flavohemoglobina, se decidió realizar un análisis de transcriptómica comparada en respuesta a NO exógeno mediante RNAseq (Wang et al., 2009). En las condiciones experimentales consideradas en los estudios farmacológicos, se comparó el patrón de expresión de las esporas en germinación del hongo en condiciones de exposición a NO con condiciones de no exposición para las cepas B05.10 y ΔBcfhg1, respectivamente. El patrón de expresión de esporas en germinación de ambas cepas también se comparó en condiciones de no exposición para eliminar genes que podrían haber cambiado su expresión debido a la mutación. El análisis de los resultados de las tres comparaciones muestra una influencia del NO en numerosos y diversos mecanismos y sistemas que incluyen el metabolismo del nitrógeno, el desarrollo asexual y sexual y el metabolismo secundario. En las esporas de tipo silvestre, el NO exógeno representó una fuente de nitrógeno alternativa para el hongo, el nitrato producido a partir de la oxidación del NO por la acción de la flavohemoglobina. El nitrato debe haber actuado como inductor transcripcional, favoreciendo la activación de los genes de su vía de asimilación, entre los que se encuentran la nitrato reductasa (BcniaD) y la nitrito reductasa (BcniiA). A continuación, mediante la acción de BcniaD y BcniiA, el nitrato fue reducido a amonio, que se incorporó al pool celular de aminoácidos mediante la biosíntesis de glutamato y glutamina (Schinko et al., 2010). Finalmente, la célula habría detectado la fuente de nitrógeno represor (amonio / glutamina / glutamato) desencadenando la represión catabólica por nitrógeno (RCN). La RCN se trata de un programa de regulación transcripcional que permite a los hongos utilizar fuentes de nitrógeno alternativas o no preferenciales (nitrato, nitrito, purinas, amidas, la mayoría de los aminoácidos y proteínas) cuando no existen fuentes preferenciales (amoniaco, glutamina y glutamato) (Milhomem Cruz-Leite et al., 2020). Por otro lado, existe una cierta alteración mediada por la regulación por calcio y cascadas de MAPKs (proteínas quinasas activadas por mitógenos), del balance entre el metabolismo fermentativo y respiratorio, del balance entre el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y del GABA (ácido γ-aminobutírico) shunt (una vía alternativa de producción de energía activada durante el estrés celular, cuando la función del ciclo de TCA está comprometida) y de la vía “del glicerol de alta osmolaridad” (HOG, por sus siglas en inglés)-MAPK, un sistema osmosensor de dos componentes que responde a diferentes tipos de estrés. Estos resultados informan de la capacidad intacta de la cepa B05.10 para hacer frente a los efectos del estrés nitrosativo y recuperar su estado homeostático normal (Baltussen et al., 2019). En las esporas mutantes, cambios en la expresión de numerosos genes relacionados con la generación y desintoxicación de especies reactivas de nitrógeno y oxígeno y de la activación de la respuesta retrógrada mitocondrial (una retrocomunicación de la mitocondria con el núcleo como consecuencia de la adaptación al estrés y que se traduce en la promoción de mecanismos citoprotectores) (Schumacher et al., 2014) muestran la mayor susceptibilidad de este sistema desprotegido al estrés nitrosativo impuesto por el NO exógeno. Asimismo, la ausencia de la flavohemoglobina determinó una RCN más intensa que en B05.10 cuya activación se atribuiría a la producción de {\rm NO}_2^- procedente de la oxidación espontánea de NO (Yamasaki, 2000; Schinko et al., 2010). El nitrito así formado habría activado BcniiA en las células mutantes, produciendo en último término la fuente de nitrógeno represor. Por otro lado, ahora la alteración del equilibrio entre el metabolismo fermentativo y respiratorio y la de la vía HOG-MAPK sugiere una posible entrada en un estado de latencia o quiescencia de las células fúngicas como consecuencia de la situación de estrés derivada de la exposición al NO. Además, se observó una fuerte influencia de la molécula sobre el secretoma y el metabolismo secundario del hongo, especialmente en este último, donde destaca un efecto regulador negativo dependiente de Bcfhg1 sobre los genes estructurales de la vía de biosíntesis de la melanina (Schumacher, 2015; Baltussen et al., 2019). La comparación del patrón de las esporas en germinación de ambas cepas en condiciones de no exposición permitió detectar la presencia de secuencias reguladoras de los genes vecinos a Bcfhg1 dentro del fragmento de ADN delecionado en la cepa ΔBcfhg1 durante su generación (Turrion-Gomez et al., 2010). Además, se atribuyó a Bcfhg1 un cierto papel regulador, dependiente del NO, sobre la expresión de un gen relacionado con el término GO de componente integral de membrana. El capítulo II se centra en la caracterización del gen Bcmed en B. cinerea. MedA fue descrito por primera vez por Clutterbuck (1969) en un análisis mutacional de mutantes morfológicos individuales en A. nidulans. En esta especie, los mutantes ΔmedA muestran un retraso en la producción de fiálides, un número reducido de conidios, la aparición de conidióforos secundarios y la sobreproducción de esterigmas primarios (métulas) en un patrón de ramificación que produce conidióforos de tipo medusoide. Esta morfología incorrecta se ha atribuido, en parte, a la expresión modificada de brlA y abaA, ya que se ha establecido que medA modula los genes que componen la vía reguladora nuclear de conidiación (brlA> abaA> wetA) a varios niveles. Desde entonces, medA también se ha estudiado en otros hongos filamentosos donde se encuentran homólogos conservados. En B. cinerea, el gen Bcmed está anotado con el código Bcin12g00460 (GenBank) y está ubicado en el cromosoma 12. Dos variantes de splicing están anotadas para este gen. Bcin12g00460.1 abarca 5 exones y su ORF predicha genera una proteína de 719 aminoácidos. La segunda variante, Bcin12g00460.2, también codifica la misma proteína. Sin embargo, la 5’ UTR de esta variante es más larga y compleja, y procede del splicing alternativo de un intrón adicional dentro de la 5’ UTR. Esto provoca la aparición de un sexto exón en esa zona en comparación con el primer transcrito. Un análisis filogenético determinó que la secuencia de aminoácidos de Bcmed muestra una alta homología a lo largo de toda la secuencia con las de representantes de las divisiones Ascomycota, Basidiomycota y Mucoromycota y el mayor grado de conservación se encontró alrededor de la región donde se ha descrito el dominio mínimo de localización nuclear de MedA en A. fumigatus. (Abdallah et al., 2012). Un análisis por RT-qPCR del patrón de expresión de Bcmed determinó que sus transcritos están presentes a lo largo de las diferentes etapas de desarrollo durante las primeras 20 horas del desarrollo del hongo en medio líquido con agitación. El gen se expresa de forma estable y constitutiva durante las primeras etapas del desarrollo, y su nivel de expresión aumenta 25 veces durante el crecimiento del micelio maduro. Para determinar la función de Bcmed seguimos una estrategia consistente en la deleción del gen y el posterior análisis de los fenotipos resultantes. Se obtuvieron dos cepas mutantes, ΔBcmed34 y ΔBcmed84, mediante la transformación de protoplastos de la cepa B05.10 con un plásmido que lleva un casete de expresión de resistencia a higromicina flanqueado por las regiones 5' y 3' del gen Bcmed, lo que permite su integración en el locus homólogo del genoma del hongo mediante recombinación homóloga. Las dos cepas deficientes en el gen Bcmed se ven afectadas en su capacidad para crecer saprofíticamente en medios sintéticos, con un retraso considerable en su crecimiento en comparación con B05.10. Su patrón de crecimiento está alterado, dando lugar a colonias densas y compactas. El micelio resultante presenta hifas beige que nunca adquieren la coloración marrón oscura característica de la cepa y que tienen una septación más espaciada que la silvestre. Es incapaz de producir macroconidios, aunque sí microconidios, pero en menor densidad. Asimismo, su capacidad de infectar a la planta hospedadora se ve afectada mostrando una agresividad reducida, probablemente debido a las alteraciones en su capacidad de crecimiento saprofítico y desarrollo. Para demostrar que el fenotipo mutante observado se debía específicamente a la deleción del gen, se llevaron a cabo intentos de obtener una cepa mutante complementada. Para ello, se utilizó un vector con un marcador de selección para nourseotricina, diferente al de la higromicina utilizado para generar el mutante, y donde se clonó el alelo silvestre de Bcmed mediante la metodología Gateway (Invitrogen). Mediante la transformación de protoplastos de la cepa ΔBcmed84, el alelo de tipo silvestre, junto con el marcador de selección para nourseotricina, se introdujo en un lugar desconocido en el fondo genético mutante. Sin embargo, esta cepa no mostró una complementación completa ya que no se logró la recuperación completa del comportamiento normal en términos de desarrollo, presentando siempre fenotipos intermedios entre el mutante y el silvestre. Una posible causa que explicaría este resultado es que la integración ectópica de Bcmed puede haber resultado en un nivel o patrón temporal de transcripción inadecuados, ya sea por un contexto de cromatina incorrecto o por la ocurrencia de silenciamiento meiótico por ADN desapareado en una ubicación ectópica (Shiu et al., 2001; Rodenburg et al., 2018). El fenotipo mutante de B. cinerea muestra diferencias con los mutantes para los ortólogos en A. nidulans y A. fumigatus donde la deleción del gen no resultó en un micelio defectuoso en el crecimiento de sus hifas o estéril, carente de conidióforos, pero sí afectó a la morfología de estos provocando la aparición de conidióforos de aspecto aberrante (Clutterbuck, 1969; Busby, et al., 1996; Ichinomiya et al., 2005; Etxebeste et al., 2010; Gravelat et al., 2010; Al Abdallah et al., 2012). En F. oxysporum, los conidióforos son reemplazados por células en forma de bastón unidas formando una sola cadena en el mutante en el gen ren1, ortólogo de Bcmed, pero su capacidad de crecimiento en medios sintéticos no se vio afectada (Ohara et al., 2004). Se detectó un fenotipo similar en los mutantes del gen ortólogo de M. grisea donde el crecimiento de las hifas no se vio afectado por la mutación, pero sí la formación de conidióforos, los cuales fueron reemplazados por un patrón acropétalo de conidiación (Lau y Hamer, 1998; Nishimura et al., 2000). Estas diferencias entre los mutantes para los ortólogos de Bcmed podrían deberse a la diferente arquitectura del conidióforo entre las especies, lo que habría provocado que la actividad de la proteína Bcmed se especializara hasta cierto punto, regulando la expresión de genes diana diferentes a los de sus ortólogos (Yu et al., 2006, Mah et al., 2006; Gravelat et al., 2010; Canessa et al., 2013; Schumacher et al., 2014; Cohrs et al., 2016; Schumacher, 2017; Schumacher and Tudzynski, 2012; Chen et al., 2010). Finalmente, en el capítulo III se recogen los resultados de los primeros análisis realizados para la caracterización del gen Bcorp1, la cual se encuentra en una etapa preliminar. El transposon tagging es una técnica basada en el uso de transposones, que debido a su capacidad para ser escindidos de su ubicación inicial e integrados en otra nueva región del genoma, permiten la identificación de genes de interés ya que la inserción de un transposón interrumpe y marca un gen al mismo tiempo (Becker et al., 2001; Dufresne and Daboussi, 2010). Villalba et al. (2001) utilizaron esta técnica, introduciendo impala, un elemento transponible Tc1-mariner de F. oxysporum, en un mutante de M. grisea deficiente en la nitrato reductasa por transformación. En la transformación se usó una copia del impala insertada en el promotor de niaD que codifica para la nitrato reductasa de A. nidulans, por lo que la escisión del impala se controló mediante la restauración de la prototrofía al nitrato. Se obtuvo un mutante no patógeno (rev77). Se analizaron las áreas flanqueantes del sitio de inserción del impala en rev77 y el mutante se complementó con éxito con un fragmento genómico de 3 kb de un locus de tipo silvestre. Se descubrió que este gen, llamado "gen huérfano necesario para la patogenicidad 1" (ORP1, por sus siglas en inglés), es esencial para la penetración en hojas de arroz y cebada. Las comparaciones de homología realizadas por BLASTP detectaron que el producto del gen Bcin09g01160 (GenBank) de B. cinerea comparte una homología significativa con orp1 de M. grisea. El gen se encuentra en el cromosoma 9 y da lugar a dos transcritos. Bcin09g01160.1 tiene una longitud de 6088 nucleótidos y consta de cinco exones de los cuales solo los dos últimos son exones codificantes. Su traducción se inicia dentro del cuarto exón dando lugar a una proteína de 859 aminoácidos. Bcin09g01160.2 tiene 6022 nucleótidos de longitud y comparte con el primero los exones primero, segundo, cuarto y quinto, pero existe un intrón dentro del tercer exón y el splicing alternativo da lugar a un transcrito procedente de los seis exones resultantes. También codifica para los mismos 859 aminoácidos. La secuencia de Bcorp1 presentó una región altamente conservada en su región central de aproximadamente 130 aminoácidos en un análisis filogenético realizado con ortólogos presentes en varias especies representantes tan solo de Pezizomycotina, ya que un análisis tipo BLASTP reportó su ausencia en otras subdivisiones. El análisis de la función de Bcorp1 se basa en el mismo enfoque utilizado para la caracterización de Bcmed, la evaluación de los fenotipos de cepas mutantes que carecen del gen. Estas cepas se obtuvieron usando un vector que alberga las regiones 5' y 3' de Bcorp1 en una posición tal que flanquean un casete de expresión de resistencia a higromicina. Por medio de la transformación de protoplastos de la cepa B05.10, el casete de resistencia al antibiótico se integró en el locus del gen Bcin09g01160, produciendo una sustitución entre los dos mediante un evento de recombinación homóloga entre las secuencias correspondientes de las regiones flanqueantes de las copias alélicas mutante y silvestre. Se obtuvieron tres cepas mutantes, ΔBcorp1-3, ΔBcorp1-19 y ΔBcorp1-45. Estas cepas mutantes no muestran alteraciones obvias del desarrollo en comparación con B05.10. Se desarrollan al mismo ritmo que la cepa control dando lugar al micelio marrón oscuro característico de esta cepa que contiene conidióforos cargados de esporas que son capaces de germinar. Por otro lado, los ensayos preliminares de virulencia realizados en hojas de judía y vid muestran que Bcorp1, al igual que su ortólogo en Magnaporthe, está involucrado en la patogenicidad. Ambas observaciones indican que el gen es un factor de patogenicidad considerando como tal a aquellos genes necesarios para el desarrollo de la enfermedad, pero no esenciales para que el patógeno complete su ciclo de vida in vitro (Idnurm y Howlett, 2001). Más específicamente, aunque la mutación del gen Bcorp1 no parece haber afectado la capacidad del hongo para infectar plantas de judía, su proteína parece estar involucrada en la infección de la vid, donde el micelio de las cepas mutantes no pudo expandirse desde el inóculo y formar lesiones. Estos resultados, junto con la consulta de datos de RNAseq disponibles online y obtenidos durante la infección por B. cinerea de diferentes hospedadores (Reboledo et al., 2020; De Cremer et al., 2013; Coolen et al., 2016; Srivastava et al., 2020; Haile et al., 2020), sugieren que la función de Bcorp1 podría depender del hospedador, ya que el gen se induce específicamente durante la infección de la vid. Además de los ensayos de virulencia, se ha realizado un análisis de expresión diferencial utilizando la tecnología de RNAseq entre muestras de micelio de la cepa B05.10 y de una de las tres cepas mutantes obtenidas por deleción, ΔBcorp1-19, cultivadas en medio sólido. Actualmente se están evaluando los resultados de este análisis y se espera que informen sobre los procesos celulares que se ven afectados en las células fúngicas debido a la deleción de Bcorp1 durante el crecimiento saprofítico.