Papel de los receptores de carga en la organización funcional de la ruta secretora temprana

Resum

Introducción La organización estructural y funcional de la célula eucariota depende, en gran medida, de la actividad de la ruta secretora. Los procesos selectivos de transporte vesicular que operan a lo largo de esta ruta, aseguran la llegada de las distintas proteínas y lípidos a sus destinos funcionales adecuados. De esta forma, se mantiene la compartimentación necesaria para que los diferentes procesos bioquímicos que tienen lugar en cada orgánulo se lleven a cabo eficientemente. El tráfico vesicular en la ruta secretora está mediado por una serie de complejos proteicos citosólicos de cubierta, que se encargan de generar las vesículas de transporte mediante la deformación mecánica de la membrana del orgánulo donador, seleccionar de manera simultánea las moléculas carga que se han de incorporar en las vesículas, y finalmente, dirigir las vesículas hacia su destino intracelular interaccionando con los factores de anclaje, que actúan previamente al evento de fusión con el orgánulo aceptor. Dos tipos de cubierta operan en la ruta secretora temprana: COPII media la exportación de proteínas de secreción del retículo endoplásmico (RE), mientras que COPI (o coatómero) está implicada en el transporte retrógrado desde el aparato de Golgi al RE y entre las cisternas del Golgi. Las proteínas de secreción que no son capaces de interaccionar con la cubierta COPII necesitan la intervención de los denominados receptores de carga. Estos receptores son proteínas muy abundantes y conservadas evolutivamente, que conectan a la carga con la cubierta para que su exportación del RE ocurra eficientemente. En esta tesis se ha pretendido profundizar a nivel molecular en la comprensión del tráfico vesicular en la ruta secretora temprana mediante el estudio de los receptores de carga y su participación en otras funciones además de las previamente descritas, utilizando como modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae. El estudio comenzó a partir del análisis del complejo p24, un receptor de carga que forma un complejo heteromérico que cicla constantemente entre el RE y el Golgi. Publicaciones previas de nuestro grupo han permitido describir su función como receptor de carga de las proteínas ancladas a GPI y como estabilizador del coatómero sobre el Golgi, ayudando en la formación de vesículas COPI. Antecedentes y objetivos Para profundizar en el conocimiento de las funciones celulares del complejo p24, se realizó un ensayo de pulldown de una de las subunidades del complejo etiquetada con TAP (Emp24-TAP). Sorprendentemente, se encontraron entre las proteínas que interaccionaban con Emp24-TAP otros receptores de carga, y los componentes del complejo Dsl1, el factor responsable del anclaje de las vesículas COPI al RE. Para analizar la importancia de estas interacciones, se estudió en primer lugar la relación del complejo p24 con los demás receptores de carga. De esta forma se observó que los receptores constituyen una plataforma de alto peso molecular a nivel de los sitios de salida del retículo, y que esta debe tener un significado funcional, ya que existe una fuerte interacción genética entre los distintos receptores. Los receptores que mayor interacción genética mostraron fueron p24 y Erv14p, por lo que se comenzó un estudio del doble mutante emp24Δerv14Δ. Los primeros resultados preliminares evidenciaron que en este doble mutante el cis-Golgi parecía desorganizado. Con estos antecedentes, los objetivos planteados en esta tesis han sido: 1. Analizar el posible papel cooperativo entre los receptores de carga en la organización funcional del cis-Golgi. 2. Analizar el posible papel del complejo p24 en el anclaje de las vesículas COPI al retículo endoplásmico. Resultados 1. Papel cooperativo de los receptores de carga en la organización funcional del cis-Golgi. Los receptores de carga del RE son componentes muy abundantes de la ruta secretora temprana que ciclan continuamente entre el RE y el Golgi en vesículas anterógradas COPII y retrógradas COPI. La función individual de estos receptores es conectar a sus respectivas proteínas de secreción específicas con la cubierta COPII para promover su incorporación eficiente en las vesículas que las llevarán desde el RE hasta el Golgi. Nuestros datos proteómicos y genéticos sugieren que además de esta función individual, los receptores desarrollarían una función colectiva necesaria para el ensamblaje del cis-Golgi. En el primer capítulo de esta tesis, se muestra cómo los receptores en su conjunto son necesarios para la homeostasis del cis-Golgi, ya que su ausencia combinada promueve la desorganización de este compartimento, hecho que no parece ser debido a un bloqueo general de la salida del RE. Este fenotipo es característico de los mutantes en los factores de anclaje de las vesículas COPII en el cis-Golgi. Es más, el alelo supresor de mutantes de anclaje SLY1-20, suprime el fenotipo de crecimiento y de cis-Golgi desorganizado del doble mutante emp24Δerv14Δ. Los resultados indican que los receptores interaccionan con el factor de anclaje Uso1p una vez han abandonado el RE. Uso1p se encuentra menos asociado a las membranas del Golgi y de las vesículas en el doble mutante emp24Δerv14Δ, sugiriendo que los receptores de carga favorecen el proceso de anclaje vesicular mediante el reclutamiento o estabilización de los factores de anclaje a las vesículas COPII. Agrupando todas las evidencias obtenidas, proponemos un modelo en el que los receptores de carga reclutarían o estabilizarían conjuntamente al factor de anclaje Uso1p a las vesículas recién evaginadas del RE, de forma que las mantendrían unidas entre sí favoreciendo la fusión posterior para formar un nuevo cis-Golgi o fusionar con el cis-Golgi pre-existente. 2. Papel de los receptores de carga en el anclaje de vesículas COPI al retículo endoplásmico Para devolver al RE aquellas proteínas que han escapado, y reciclar los factores de transporte requeridos para futuras rondas de tráfico anterógrado, entre el Golgi y el RE existe un transporte retrógrado mediado por vesículas COPI. Al aproximarse al RE, estas vesículas son capturadas por el complejo de anclaje Dsl1 mediante la interacción entre su subunidad Dsl1p y la cubierta COPI. De esta manera, Dsl1 facilita la interacción de la vesícula con el RE para su posterior fusión. Cuando Dsl1p contacta con el coatómero, promueve a su vez su despolimerización y la vesícula comienza a desnudarse. De esta forma, en ese momento la vesícula quedaría sin sujeción a la membrana del RE, con lo que podría escapar de las inmediaciones de este orgánulo, con la consecuente pérdida de eficiencia en la fusión. En el segundo capítulo de esta tesis se han obtenido resultados que permiten proponer que los receptores de carga tendrían un papel en que la vesícula quede cerca del RE hasta que ocurra la fusión. Los resultados obtenidos indican que los receptores de carga p24 y Erv14p interaccionan físicamente in vivo con el complejo de anclaje vesicular Dsl1. Además, al menos en el caso del complejo p24, esta interacción es directa in vitro. Los estudios de interacción genética han mostrado que esa interacción física tiene un significado funcional en la célula, hecho que también se ha deducido por tener el doble mutante emp24Δtip20-8 más defectos que los mutantes simples en el anclaje de las vesículas COPI al RE. Dicha interacción funcional parece basarse en una colaboración entre los receptores de carga que viajan en las vesículas COPI y Dsl1, como indica el hecho de que en un mutante del coatómero la interacción física entre los receptores y el complejo Dsl1 disminuya, o que sólo sea capaz de recuperar el crecimiento del doble mutante erv14Δtip20-8 la versión silvestre del receptor, y no una que es incapaz de abandonar el RE. Por último, los receptores de carga parecen actuar conjuntamente en el transporte retrógrado, ya que la expresión de ERV14 silvestre es capaz de suprimir los defectos de crecimiento dobles mutantes de alelos termosensibles de los miembros de Dsl1 y emp24Δ. Con los datos obtenidos proponemos el siguiente modelo: los receptores de carga presentes en la vesícula COPI contactan con el complejo Dsl1 tras la despolimerización de la cubierta, manteniendo así a la vesícula en las cercanías del RE y evitando que esta se aleje, aumentando de esta forma la eficiencia del proceso de anclaje llevado a cabo por el complejo Dsl1. Conclusiones Los resultados obtenidos en este trabajo permiten concluir que: 1- Los receptores de carga presentan un papel cooperativo necesario para la biogénesis del cis-Golgi, mediante el reclutamiento de los factores de anclaje vesicular. 2- Los receptores de carga aumentan la eficiencia del anclaje de las vesículas COPI al retículo endoplásmico mediante su interacción con el complejo Dsl1.