Señalización por NDR kinasas durante el crecimiento polarizado en C. albicans

Resumen

Candida albicans es un microorganismo oportunista que forma parte de la microbiota habitual del ser humano (Hall y Noverr, 2017; Nash et al., 2017; Williams et al., 2013). En respuesta a diferentes señales ambientales o inmunosupresión, este hongo puede pasar de su estado comensal a patógeno-oportunista, pudiendo causar enfermedades como las candidiasis y las candidemias (Cottier y Hall, 2019; Pappas et al., 2018; Tsui et al., 2016). C. albicans presenta una alta plasticidad morfológica, pudiendo crecer en forma de levadura, hifa o pseudohifa. Estos cambios morfogenéticos, reversibles entre sí, se producen en respuesta a distintos factores externos (como el pH o la temperatura) y se integran en varias rutas de señalización implicadas en morfogénesis y polarización celular. Una de estas rutas es la ruta RAM (Saputo et al., 2012), la cual desempeña un papel esencial en la regulación del crecimiento polarizado, y el efector final de esta ruta, la kinasa Cbk1, se localiza en las zonas de crecimiento de la célula. Cbk1 es necesaria para polarizar el crecimiento en respuesta a suero, ya que las células cbk1∆∆ son incapaces de formar tubos germinativos (Song et al., 2008). En las etapas iniciales de la formación de la hifa, cuanto la función de Cbk1 depende de Ssd1, las hifas cbk1∆∆ ssd1∆∆ son más cortas y anchas que las de la cepa silvestre tras generar el primer septo (Rojo-Domínguez, 2018), lo que indica que en las etapas posteriores del desarrollo hifal Cbk1 tiene una función independiente de Ssd1, posiblemente regulando otros procesos necesarios para el crecimiento polarizado. Para poder inactivar la actividad catalítica de Cbk1 en el momento deseado de la filamentación y prescindir de la deleción de SSD1, se utilizó el mutante condicional cbk1-as/cbk1Δ (Analogue-Sensitive), sensible al análogo de ATP, 1NM-PP1, la cual se comporta como una cepa silvestre en ausencia del análogo y como el mutante cbk1ΔΔ en presencia de este. Esta cepa se creció con y sin análogo en condiciones de filamentación y se realizó el seguimiento del crecimiento de las hifas mediante experimentos de time-lapse. Tras la adicción del análogo se produce la detención casi inmediata del crecimiento, y en los tiempos finales del experimento comienzan a formarse algunas yemas laterales en el compartimento subapical, indicando que la actividad kinasa de Cbk1 es esencial para el mantenimiento del crecimiento polarizado en las etapas tardías de la filamentación. Se estudió la localización de algunos de los componentes de polaridad durante el proceso de filamentación, ya que estas proteínas podrían estar reguladas por Cbk1, utilizando el mutante condicional cbk1-as/cbk1Δ. Durante la formación de las hifas, se observó que la actividad kinasa de Cbk1 era necesaria para mantener a los parches de actina (Abp1), el polarisoma (Spa2) y el exocisto (Exo84 y Sec3) polarizados en la zona apical, ya que al inhibir la actividad kinasa el crecimiento hifal se detenía y comenzaba a ensancharse el ápice, además de que comenzaba a reactivarse el ciclo celular en la célula subapical de la hifa formando yemas laterales. Sin embargo, la actividad kinasa de Cbk1 no afecta directamente a la localización polarizada de Cdc42 activo. En C. albicans, la división celular es asimétrica tanto en levaduras como en hifas, ya que la célula madre y la hija tienen distinto comportamiento tras la citoquinesis. Durante la filamentación, la célula subapical detiene el ciclo celular tras la citoquinesis y se queda bloqueada en fase G1, mientras que la célula apical continúa creciendo y dividiéndose, alargando el filamento (Gow y Gooday, 1987). Esta asimetría celular hace que haya una distribución asimétrica de algunos factores de transcripción, como el represor Nrg1, que se acumula en los núcleos subapicales haciendo que la expresión de los genes específicos de hifas (HSGs) ocurra mayoritariamente en el compartimento apical (Bermejo-Pulido, 2016). En este trabajo hemos caracterizado la localización del factor de transcripción Ace2 durante el crecimiento de las hifas, ya que en trabajos anteriores existía una cierta controversia sobre si su localización está restringida al núcleo de la célula apical (Bharucha et al., 2011) o se distribuye tanto en el núcleo de la célula apical como en el de la subapical (Calderón-Noreña et al., 2015; Kelly et al., 2004). Nuestro trabajo demuestra que se localiza en ambos compartimentos, pero de manera asimétrica, acumulándose preferentemente en la célula apical. También hemos demostrado que Cbk1 es responsable de generar este patrón asimétrico, pues tras inhibir su actividad se pierde la asimetría y Ace2 pasa a localizarse en ambas células con una intensidad de fluorescencia similar. Por tanto, en el caso de Ace2, la actividad de Cbk1 es necesaria para la localización asimétrica de Ace2 tanto en levaduras como en hifas. Para identificar posibles sustratos de Cbk1 relacionados con el crecimiento polarizado en las etapas tardías del desarrollo hifal, durante la fase independiente de Ssd1, se realizó una búsqueda informática del proteoma de C. albicans para identificar todas las proteínas de este organismo que contenían al menos un sitio consenso de fosforilación de las NDR kinasas, que se ajusta al consenso H-X-(K/R)-X-X-(S/T) o H-X-X-(K/R)-X-(S/T) (Mazanka et al., 2008). Se seleccionaron posibles sustratos que están relacionados con morfogénesis y crecimiento polarizado, como la GTPasa Crl1/Rho4 (3 sitios de fosforilación) y el componente del exocisto Exo84 (3 sitios de fosforilación), ambos presumiblemente implicados en el proceso de secreción y exocitosis. Para el estudio de Rho4, se decidió generar mutantes fosfomiméticos (rho4-3E/rho4∆) y fosfodeficientes (rho4-3A/rho4∆) en los tres sitios fosfoaceptores (S274, S278 y S292) para analizar si estos desempeñan algún papel durante el desarrollo hifal. Se ha observado que los sitios de fosforilación por NDR kinasas son importantes para su función en la regulación de la separación celular, tanto en levaduras como en las hifas, cuando se reactiva el ciclo celular en los compartimentos subapicales. Además, durante la filamentación, la presencia de cargas negativas en los sitios de fosforilación favorece el crecimiento de las hifas. Este hecho podría indicar que la fosforilación de estos tres sitios promueve la asociación de la proteína con las membranas del aparato secretor que se localiza a lo largo de la hifa (Weiner et al., 2019), favoreciendo el crecimiento altamente polarizado de este morfotipo, posiblemente atrayendo las vesículas de secreción hacia el ápice con mayor eficiencia que las otras dos proteínas. Se analizó la localización de la proteína Rho4 durante el crecimiento levaduriforme e hifal, comprobando que se localizaba transitoriamente en el plano división junto a las septinas cuando el anillo comenzaba a duplicarse, como se ha descrito previamente (Dünkler y Wendland, 2007). Sin embargo, Rho4 también se localizaba en el córtex celular, tanto de la célula madre como de la hija, en forma de puntos o parches corticales, algunos de los cuales eran altamente dinámicos y otros se mantenían un poco más tiempo asociados a la membrana. En este trabajo demostramos que el tiempo de asociación de la proteína Rho4 con el septo de las hifas parece depender de la fosforilación y defosforilación de los tres sitios mutados. Es interesante que, tanto en levaduras como en hifas, el tiempo de permanencia del mutante fosfodeficiente en el plano de división es mayor que la proteína silvestre, lo que sugiere que la fosforilación de estos sitios promueve su disociación de la zona del septo en ambas condiciones de crecimiento, al tiempo que su fosforilación sería necesaria para la localización apical en la membrana. Cuando se analizó la movilidad electroforética de las distintas versiones, se comprobó que Rho4 podría sufrir una fosforilación diferencial en función de su morfología, ya que en levaduras presenta una menor movilidad electroforética que en hifas. Será necesario comprobar si esta fosforilación depende directamente de la kinasa Cbk1. Para el estudio de la subunidad del exocisto Exo84 se generaron mutantes fosfomiméticos y fosfodeficientes en los tres sitios consenso de fosforilación por Cbk1 (S118, T418 y S511). Se ha observado que estos sitios no son esenciales para el crecimiento filamentoso en C. albicans, pero cuya fosforilación podría contribuir a mantener una elongación apical eficiente, aumentando la tasa de crecimiento polarizado.