The influence of chromatin in DNA-RNA hybrid metabolism

Resum

El genoma, el conjunto de genes de un organismo o especie, debe copiarse de forma fidedigna de célula a célula. Sin embargo, existen situaciones que comprometen la estabilidad del genoma dando lugar a la aparición de mutaciones, roturas en el ADN, reordenamientos cromosómicos, etc...que en último lugar pueden desencadenar la muerte celular o incluso la aparición de tumores. La relevancia del mantenimiento de la estabilidad del genoma se hace patente en el hecho de que la evolución ha desarrollado complejos mecanismos de reparación y respuesta al daño en el ADN para prevenir la inestabilidad genética. Sin embargo, el ADN no está exento al ataque de numerosos factores que pueden condicionar su estabilidad, desde agentes exógenos hasta el propio metabolismo celular. En concreto, se conoce que los procesos de transcripción y replicación del ADN son una fuente importante de inestabilidad genética. Aunque existen diversos motivos por los que estos dos mecanismos pueden generar daño en el ADN, uno de los más estudiados es la formación de R loops. Estos son estructuras formadas por un híbrido de ADN-ARN que desplaza la otra hebra del ADN dejándola en forma de cadena sencilla, más susceptible al ataque de determinados agentes como la enzima AID. Aunque los híbridos de ADN-ARN desempeñan papeles fisiológicos en las células, su acumulación puede potenciar la inestabilidad genómica. Un claro ejemplo de esto lo constituyen los mutantes del complejo THO, un complejo proteico que interviene en la formación de la ribonucleopartícula uniéndose al ARNm en formación y facilitando su exportación fuera del núcleo. En ausencia de dichos factores, la desprotección del ARNm permite su unión al ADN molde, dando lugar a una acumulación co-transcripcional de híbridos de ADN-ARN que generan altos niveles de inestabilidad genética, principalmente detectada como recombinación entre secuencias repetidas. Asimismo, existen proteínas implicadas en la eliminación de los híbridos una vez formados, como las RNasas H y ciertas helicasas. Es importante destacar que en el genoma de los eucariotas, el ADN no se encuentra desnudo en el núcleo de la célula sino que se asocia con determinadas proteínas dando lugar a la estructura de la cromatina cuyas unidades básicas son los nucleosomas. Cada uno de ellos está formado por un octámero proteico que contiene dos copias de cada una de las cuatro histonas H3, H4, H2A y H2B. La colas amino-terminales de las histonas sufren modificaciones post-traduccionales como metilaciones, acetilaciones, fosforilaciones o ADP-ribosilaciones que pueden tener consecuencias tanto para la estructura de la cromatina como para todos los procesos básicos del ADN, incluida la formación de híbridos de ADN-ARN. Estudios previos en el laboratorio identificaron ciertas mutaciones en las colas amino terminales de las histonas H3 y H4 que Estos híbridos a diferencia de los que se acumulan otros mutantes como los del complejo THO, no dan lugar a un incremento de la inestabilidad genómica, ni por un aumento de la recombinación entre secuencias repetidas ni tampoco mediante una acumulación de focos de Rad52. En esta tesis profundizamos en el estudio de dichos mutantes de histonas, analizando los niveles de pérdida de heterozigosidad o pérdida de cromosomas y hemos conseguido medir la longitud y la frecuencia de los R loops gracias a la puesta a punto de una técnica basada en el uso de bisulfito sódico in vitro. Además, hemos utilizado una versión hiper-mutagénica de la AID con el fin de poder mapear los híbridos en todo el genoma in vivo. Hemos observado que los R loops que se acumulan en los mutantes de histonas tienen la misma longitud que aquellos que están presentes en cepas silvestres u otros mutantes que dan lugar a la acumulación de híbridos como los del complejo THO. Los resultados de esta tesis, por tanto, nos han llevado a concluir que la longitud de los R loops no es un factor determinante en la generación de inestabilidad genética mediada a través de estas estructuras. Por último, para identificar nuevos factores de la cromatina que tengan un papel en el metabolismo de los R loops, hemos realizado una búsqueda para identificar mutantes en remodeladores de cromatina o modificadores de histonas. Hemos encontrado que la deleción de la acetil-transferasa Rtt109 provoca un incremento de R loops dependiente de su actividad catalítica, y gracias al análisis de distintas mutaciones en las histonas H3 y H4 hemos asociado dicho incremento con dianas concretas de entre todas las descritas para Rtt109 in vivo o in vitro. Por otra parte, dado que Rtt109 tiene un papel en la reparación de roturas de doble cadena del ADN, previamente descrito en nuestro laboratorio, hemos estudiado la relación entre los fenotipos de defecto en la reparación y la acumulación de híbridos de ADN-ARN, tanto en ausencia de Rtt109 como en los mutantes individuales en sus dianas. Los resultados de esta tesis nos indican que la acumulación de híbridos de ADN-ARN no es un impedimento para la correcta reparación de roturas de doble cadena, ni tampoco son la causa de todo el daño presente en ausencia de Rtt109. No obstante, concluimos que la persistente acumulación de roturas de doble cadena podría favorecer la formación de híbridos de ADN-ARN. De esta forma, el trabajo manifiesta la relevancia del contexto cromatínico en el que se encuentra el ADN en la formación de R loops.