Regulación de la rutas de tolerancia a daños replicativos dependientes de RAD6, RAD5 y RAD52 durante el ciclo celular en Saccharomyces cerevisiae

Resumen

Regulación de la rutas de tolerancia a daños replicativos dependientes de RAD6, RAD5 y RAD52 durante el ciclo celular en Saccharomyces cerevisiae. Argumento: Los mecanismo de tolerancia a daños replicativos (DDT; DNA damage Tolerance) constituyen una pieza fundamental en la respuesta celular a daños en el ADN. Facilitan la replicación a través de lesiones que interfieren con el avance de las horquillas replicativas, priorizando esta función sobre la reparación del daño. Estos mecanismos, que pueden ser o no mutagénicos dependiendo de que rellenen los fragmentos de ADN de cadena sencilla generados durante el salto de la lesión utilizando como molde la cadena dañada o la cromátida hermana, son esenciales para la correcta progresión a lo largo del ciclo celular y el mantenimiento de la integridad genómica. En consecuencia, mutaciones que afectan la eficiencia de estos mecanismos están íntimamente ligados a los procesos tumorales. A pesar de la DDT, los mecanismo y su regulación son poco conocidos. Por tanto esta tesis trata de dilucidar las relaciones mecanísticas entre las rutas de tolerancia al daño replicativo (dependientes de Rad6, Rad5 y Rad52) y la relación de estas rutas con los mecanismos de control del ciclo celular (en particular de la actividad de las quinasas dependiente de ciclo y de checkpoint). Introducción: La respuesta a daños en el ADN funciona como una barrera que previene la inestabilidad genómica (Halazonetis et al.,2008). La integridad de la horquilla de replicación es un componente central en esta respuesta, y mutaciones que afectan a los mecanismos implicados en la detección, estabilización y reparación de las horquillas dañadas conducen a inestabilidad genética. En cada ciclo celular, un amplio número de agentes exógenos y endógenos causan lesiones en el ADN que interfieren con el avance de las horquillas. Por ejemplo, la exposición a la luz ultravioleta o a agentes alquilantes, los cuales distorsionan localmente la hélice de ADN y bloquean las horquillas de replicación. Esto desacopla los procesos de desenrrollamiento y síntesis de ADN corriente abajo de la lesión. Por tanto, un parte importante de la Respuesta de Daños en el ADN tiene como objetivo promover la replicación a través de lesiones en el ADN y reparar los fragmentos de ssDNA generados durante el proceso, priorizando la replicación sobre la reparación de la lesión inicial. Por ello, se conocen como mecanismos de tolerancia a daños replicativos (DDT, DNA damate tolerance) (Friedberg et al., 2005). Los fragmentos de ssDNA son reparados mediante mecanismos de síntesis translesión (TLS) y de cambio de molde (TS). Mientras que los primeros rellenan el fragmento de ssDNA extendiendo el extremo 3’ a través del ADN dañado usando para ello polimerasas específicas capaces de incorporar un nucleótido en la posición opuesta a la lesión, los segundos utilizan la información de la cromátida hermana como molde. En consecuencia, la decisión entre TLS y TS determina si la reparación es o no mutagénica y, por tanto, es un determinante clave en el desarrollo del cáncer (Prakash et al.,2005). Una proteína crucial en esta decisión es PCNA, factor de procesividad de la polimerasa de ADN. En respuesta a daños en el ADN, PCNA se ubiquitina en la lisina 164 por el complejo ubiquitin ligasa Rad6/Rad18, y esta modificación sirve como diana para el reclutamiento de las polimerasas de TLS. Por el contrario, la reparación por TS requiere que el complejo ubiquitin ligasa Ubc13/Mms2/Rad5 extienda la lisina ubiquitinada en posición 164 a una cadena de poliubiquitina, aunque en este caso se desconoce la función de esta modificación. Adicionalmente, la lisina K164 puede sumoilarse; esta modificación, ya presente en ausencia de daños replicativos, es llevada a cabo por el complejo SUMO ligasa Ubc9/Siz1 y recluta a la helicasa Srs2 para prevenir la recombinación homóloga. Esta observación está en aparente contradicción con el hecho de que aparte de las rutas dependientes de RAD6, las proteínas de Recombinación Homóloga del grupo de epistasia de RAD52 son también necesarias para la DDT, aunque su contribución mecanística en DDT no está clara (Friedberg et al., 2005). Las relaciones entre estas rutas son aún más complejas por cuanto se han descrito interacciones tanto moleculares como celulares entre las proteínas de Recombinación Homóloga y las polimerasas mutagénicas (McIlwraith et al., 2005). Tampoco está claro el momento de acción de las proteínas de DDT. En particular, una cuestión mecanística particularmente importante es si la reparación del fragmento de ssDNA está acoplada a la horquilla de replicación u ocurre post-replicativamente. La eficiencia de la respuesta a daño replicativo no se ve afectada cuando la expresión de los genes del grupo de epistasia de RAD6 se restringe a G2/M, lo que sugiere que esos mecanismos pueden funcionar desacoplados de la horquilla (Karras et al.,2010). Sin embargo las proteínas de Recombinación Homólogas Rad52 y Rad51 son necesarias para el avance de las horquillas de replicación a través el ADN alquilado, indicando qué o bien toleran el daño mediante una ruta independiente a la de RAD6, o tienen funciones específicas de fase S aún por determinar. Alternativamente, la ruta de reparación dependiente de RAD6 podría operar acoplada a la horquilla, como se ha sugerido a partir de datos que demuestran que Rad5 tiene una actividad helicasa capaz de revertir horquillas bloqueadas a estructuras cruciformes in vitro (Blastyak et al.,2007). De hecho, la proteína de Recombinación Homóloga Rad51 podría también realizar esta reversión. Desarrollo Teórico: En los últimos años, se ha estudiado el papel de las proteínas de Recombinación Homóloga en la DDT. El principal obstáculo para abordar estos estudios es la dificultad para discriminar si un suceso de reparación por Recombinación Homóloga está asociado a un fragmento de ssDNA o a un corte de doble cadena. Para revolver esto se ha usado la metodología ChEC (Corte endógeno de la cromatina), basada en la expresión de proteínas fusionadas a la nucleasa micrococal. Esta aproximación permitió estudiar la unión de proteínas a daños que no son cortes de doble cadena. Esta técnica junto con el estudio de centros de reparación (mediante el uso de proteínas fusionadas a la proteínas verde, GFP) permitió llegar a las siguientes conclusiones (González-Prieto et al., 2013): 1. Rad52 y Rad51 son reclutadas a las horquillas de replicación y etas interacción es independiente de daño replicativo. Rad52 y Rad51 facilitan el avance de las horquillas a través de daños en el ADN mediante funciones replicativas, no reparacionales, desconocidas. 2. El reclutamiento de Rad52 y Rad51 a las horquillas de replicación es un requisito imprescindible para la reparación de daños replicativos por Recombinación Homóloga. 3. Los checkpoints replicativos inhiben la reparación de los ssDNA durante la fase S y la posponen a G2/M. Teniendo en cuenta estos datos previos, el principal objetivo a alcanzar en esta tesis ha sido determinar la relación mecanística entre las rutas de RAD6, RAD5 y RAD52 durante la tolerancia a daños replicativos. Conclusión: Los datos mostrados en esta tesis sugieren que Rad52 coopera mediante funciones no recombinogénicas con la maquinaria de TLS en la reparación post-replicativa de los fragmentos de ssDNA generados durante la DDT. La reparación de los fragmentos de ssDNA por la vía Rad52/TLS requiere la expresión post-replicativa de Rad18. Además, se ha visto que la ruta recombinacional de TS nos está asociada a los centros de reparación de G2/M en respuesta a daños generados por agentes alquilantes. Por lo tanto, se puede concluir que hay una relación intrínseca entre las rutas de Recombinación Homóloga y la ruta de TLS. Bibliografía: Blastyak, A., Pinter, L., Unk, I., Prakash, L., Prakash, S., & Haracska, L. (2007). Yeast Rad5 protein required for postreplication repair has a DNA helicase activity specific for replication fork regression. Molecular Cell, 28(1), 167–175. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2007.07.030 Friedberg, E. C. (2005). Suffering in silence: the tolerance of DNA damage. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6, 943. Retrieved from http://dx.doi.org/10.1038/nrm1781 Gonzalez-Prieto, R., Munoz-Cabello, A. M., Cabello-Lobato, M. J., & Prado, F. (2013). Rad51 replication fork recruitment is required for DNA damage tolerance. The EMBO Journal, 32(9), 1307–1321. https://doi.org/10.1038/emboj.2013.73 Halazonetis, T. D., Gorgoulis, V. G., & Bartek, J. (2008). An oncogene-induced DNA damage model for cancer development. Science (New York, N.Y.), 319(5868), 1352–1355. https://doi.org/10.1126/science.1140735 Karras, G. I., & Jentsch, S. (2010). The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell, 141(2), 255–267. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.02.028 McIlwraith, M. J., Vaisman, A., Liu, Y., Fanning, E., Woodgate, R., & West, S. C. (2005). Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Molecular Cell, 20(5), 783–792. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.10.001 Prakash, S., Johnson, R. E., & Prakash, L. (2005). Eukaryotic translesion synthesis DNA polymerases: specificity of structure and function. Annual Review of Biochemistry, 74, 317–353. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.74.082803.133250