Síntesis, aislamiento y evaluación de nuevos biofenoles como potenciales agentes antiproliferativos

Zusammenfassung

La presente Tesis Doctoral se centra principalmente en la búsqueda de nuevos fenoles con potencial bioactividad; estos derivados han sido obtenidos, bien por semisíntesis a partir de fenoles naturales (incluyendo síntesis química y quimioenzimática), o mediante el desarrollo de nuevos sistemas de extracción a partir de plantas medicinales y hoja del olivo. Se ha evaluado la capacidad antioxidante de los derivados preparados (actividad antirradicalaria, captación de H2O2, inhibición de la peroxidación lipídica, actuación como miméticos de la glutatión peroxidasa), así como su actividad antiproliferativa in vitro, lo que ha permitido establecer interesantes relaciones estructura-actividad. Esto último se ha llevado a cabo en colaboración con el Profesor José Manuel Padrón (Universidad de La Laguna, Tenerife), evaluando los nueos compuestos frente a 6 líneas tumorales de tumores sólidos humanos: A549 (pulmón, célula grande), HBL-100 (mama), HeLa (cérvico-uterino), SW1573 (alveolo de pulmón), T-47D (mama) y WiDr (colon); las 4 primeras líneas son sensibles a fármacos mientras que las dos últimas son fármaco-resistentes. Para los derivados más potentes, se ha evaluado además la selectividad frente a células no tumorales (fibroblastos humanos). En el primer capítulo, titulado “Síntesis de nuevos derivados organocalcógenos”, se ha llevado a cabo la síntesis de una amplia variedad de compuestos organosulfurados y organoselénicos derivados de fenoles (hidroxitirosol, O-metilnorepinefrina) y 7-amino-4-metilcumarina: heterocumulenos (isotio e isoselenocianatos), tioureas, selenoureas, selenocarbamatos, selenocianatos, disulfuros, selenuros y diselenuros. Se comprobó que los derivados organoselénicos poseen, en general, una actividad antiproliferativa muy superior a la de los correspondientes tio-isósteros. En particular, las selenoureas derivadas de O-metilnoreprinefrina con grupos electrón-atrayentes en el anillo aromático (halógeno, NO2, Ph) exhibían valores de GI50 inferiores a 10 µM para todas las líneas ensayadas, actividad superior a la de algunos fármacos comúnmente empleados en quimioterapia (5-fluorouracilo, cisplatino), especialmente en las líneas resistentes a multifármaco. Un estudio de la alteración del ciclo celular de las células tumorales mostró la acumulación de células en las fases G1 o G2/M a bajas concentraciones del compuesto ensayado, mientras que, a concentraciones superiores, se observó la muerte celular, especialmente para la línea del cáncer de mama (incremento del compartimento sub-G1). Adicionalmente se comprobó un importante incremento de los niveles de ROS en la línea tumoral, lo que es consistente con la observación de la muerte celular, probablemente mediante apoptosis. Datos previos obtenidos en el grupo de investigación donde se ha desarrollado la presente Tesis Doctoral sugieren que las selenoureas pueden comportarse como miméticos de la selenoenzima glutatión peroxidasa (GPx), un sistema antioxidante natural para la eliminación de peróxidos. En esta Tesis Doctoral se ha preparado una serie de N,N′-diarilselenoureas que han sido evaluadas como miméticos de la GPx con objeto de profundizar en su modo de acción; las representaciones de Hammett, considerando la velocidad de eliminación de los ROS en función de los sustituyentes en el anillo de arilo, así como cálculos de modelización molecular, han permitido proponer un ciclo catalítico para esta actividad antioxidante. Se ha preparado también una extensa familia de organocalcógenos derivados del hidroxitirosol (HT), un potente antioxidante natural presente en el olivo: disulfuros, diselenuros y selenocianatos, modificándose también la naturaleza y longitud del espaciador, así como la presencia de hidroxilos fenólicos libres o protegidos. En la estructura optimizada, un diselenuro derivado del ácido 4,4′-diselenobisbutírico y del hidroxitirosol protegido como metilideno acetal, se obtuvieron valores de GI50 en el rango submicromolar para todas las líneas tumorales ensayadas, y una selectividad de 38 veces con respecto a las células no tumorales. En los derivados de cumarina, las selenoureas se comportaron como agentes antiproliferativos significativamente más potentes que los correspondientes selenocarbamatos (GI50 en el rango micromolar bajo), mostrando una clara influencia de la naturaleza de la función organoselénica en la actividad biológica. También se observó un incremento de los niveles de ROS en las células tumorales, sugiriendo que uno de los modos de acción podría ser como pro-oxidantes, acción similar a la encontrada en los derivados de O-metilnorepinefrina. Cálculos in silico permitieron predecir que las selenoureas derivadas de cumarina podrían comportarse como buenos inhibidores de la histona desacetilasa 8, considerada en la actualidad como una diana terapéutica en la búsqueda de nuevos agentes antitumorales; los ensayos in vitro permitieron demostrar esta observación, en particular para una selenourea dimérica derivada de cumarina. Además, las selenocumarinas preparadas no actúan, en general, como sustratos de la glicoproteína-P, responsable de la resistencia a fármacos de las células tumorales donde se sobreexpresa como una vía de desintoxicación, por lo que fármacos basados en esta estructura, no generarían resistencia en su uso en quimioterapia. Debido a las interesantes propiedades biológicas exhibidas por el hidroxitirosol y muchos de sus derivados, en el el segundo capítulo, “Éteres y tio derivados del alcohol protocatecuico”, se ha abordado la preparación de derivados del alcohol protocatecuico (3,4-dihidroxifenilmetanol), un análogo del hidroxitirosol con la cadena alquílica más corta. Así pues, mediante una nueva metodología sintética en un solo paso, la reacción del alcohol protocatecuico con alcoholes lineales de cadena variable (C1C18, incluyendo los alcoholes mono y di-insaturados oleico y linoleico), en presencia de resina IR-120(H+) como catalizador ácido, condujo a los correspondientes alquil/alquenil éteres; se pretende de esta forma, analizar la influencia de balance hidrófobo/hidrófilo en la actividad biológica. Los estudios antiproliferativos mostraron una clara influencia de la longitud de la cadena; así pues, longitudes cortas mostraron actividades moderadas, que crecen (especialmente para la línea SW1573, pulmón) hasta llegar al dodecanol, que exhibe actividades en el intervalo micromolar bajo para todas las líneas, y submicromolar para la SW1573. Se alcanza además una excelente selectividad con respecto a las células no tumorales (fibroblastos humanos BJ-hTert), que para la SW1573 llega a ser de 210 veces. Se observó que la acetilación de los hidroxilos fenólicos condujo a compuestos que también presentan buenas actividades. Adicionalmente, con un procedimiento de síntesis similar para la preparación de los éteres, se obtuvieron sulfuros y disulfuros simétricos, así como tioles derivados del alcohol protocatecuico, observándose una importante influencia en la actividad antiproliferativa de la longitud del espaciador que conecta a los fragmentos fenólicos en los sulfuros y disulfuros; el derivado más activo fue el disufuro simétrico derivado del alcohol protocatecuico (intervalo micromolar bajo), con una mejora de hasta 17 veces con respecto al disulfuro derivado del HT, previamente sintetizado en el grupo de investigación. El tercer capítulo, titulado “Sulfatación quimioenzimática del tirosol, hidroxitirosol y de sus derivados acetilados” se ha desarrollado durante una estancia de tres meses (2017) en el Instituto de Microbiología de la Academia de Ciencias de Praga, bajo la dirección del Profesor Vladimír Krên, donde se ha utilizado la arilsulfato sulfotransferasa bacteriana (AST) de Desulfitobacterium hafniense como biocatalizador para la sulfatación de los fenoles naturales presentes en el olivo. Dichos derivados sulfatados son compuestos de gran interés ya que se generan de manera natural durante su metabolismo tras ser ingeridos, siendo difíciles de obtener por síntesis química convencional. Durante estas sulfataciones se ha observado quimioselectividad hacia los hidroxilos aromáticos, por lo que se puede evitar la protección de los hidroxilos alifáticos, permitiendo así la preparación de los metabolitos sulfatados en una sola etapa. A su vez, se ha observado una ligera preferencia por la enzima hacia el hidroxilo aromático de la posición 3 del hidroxitirosol, y hacia el de la posición 4 en el hidroxitirosol-2′-acetato. A su vez, se ha confirmado que la sulfatación disminuye las propiedades reductoras, captadora de radicales libres y de anti-lipoperoxidación de los compuestos fenólicos analizados. En el cuarto capítulo se ha abordado la búsqueda de alternativas a los métodos convencionales de extracción de compuestos fenólicos de una planta medicinal y de hojas de olivo. Parte de este capítulo titulado “Extracción de compuestos fenólicos con disolventes eutécticos profundos naturales (NADES),” fue desarrollado durante una estancia de tres meses (2016) en la universidad de Leiden (Holanda) bajo la dirección del Profesor Young Choi; en dicha estancia, se empleó una metodología novedosa englobada en la llamada Química Verde, que consiste en el uso de NADES para la extracción, aislamiento, identificación y cuantificación por HPLC de una serie de flavonoides presentes en la planta medicinal china Scutellaria baicalensis, tales como escutellarina, escutellareína, baicalina, baicaleína, oroxilinósido, wogonósido, wogonina y oroxilina A. Estos compuestos presentan prometedoras aplicaciones farmacológicas, cosméticas y alimentarias, ya que son conocidos por sus notables propiedades biológicas. Además, se ha desarrollado como alternativa al método convencional de extracción de fenoles del olivo, generalmente basado en extracciones con mezclas hidro-alcohólicas, el empleo de NADES comestibles para el aislamiento de la oleuropeína presente en la hoja de olivo. The present PhD Thesis focuses mainly on the search for new phenols with potential bioactivity; these derivatives have been obtained, either by semisynthesis from natural phenols (including chemical and chemoenzymatic synthesis), or by developing new extraction systems from medicinal plants and olive tree. The antioxidant activity of the prepared derivatives has been evaluated (antiradical, H2O2 scavenging, inhibition of lipid peroxidation, glutathione peroxidase-like activity) as well as its in vitro antiproliferative activity, which has allowed the establishment of interesting structure-activity relationships. The latter was carried out in collaboration with Professor José Manuel Padrón (University of La Laguna, Tenerife), using a panel of six human solid tumor cell lines: A549 (non-small-cell lung), HBL-100 (breast), HeLa (cervix), SW1573 (non-small-cell lung) as drug sensitive lines, T-47D (breast) and WiDr (colon) as drug resistant lines. The selectivity against non-tumor cells (human fibroblasts) has also been tested for the more potent derivatives. In the first chapter, entitled “Synthesis of new organocalcogenic derivatives”, the synthesis of a wide variety of organosulfur and organoselenium derivatives starting from phenols (hydroxytyrosol, O-methylnorepinefrine) and 7-amino-4-methylcoumarin was carried out: heterocumulenes (isothio- and isoselenocyanates), thioureas, selenoureas, selenocarbamates, selenocyanates, disulfides, selenides and diselenides. In general, a much higher antiproliferative activity was found for selenium-containing derivatives than for the corresponding thio-isosters. In particular, selenoureas derived from O-methylnorepinefrine bearing electron-withdrawing groups (halogen, NO2, Ph) on the phenyl ring exhibited GI50 values ˂ 10 µM for all the tested cell lines, improving the values achieved for some marketed drugs commonly used in chemotherapy (5-fluorouracil, cisplatin) particularly in drug resistant cell lines. A study of the alteration of the cell cycle of the tumor cells showed the accumulation of cells in the G1 or G2/M phase at low concentrations of the tested compound, whereas, at higher concentrations, cell death was observed, particularly for the breast cancer cell line, as denoted by the increase of accumulation in the sub-G1 compartment. In addition, a significant increase in ROS levels in the tumor cell line was found, that is consistent with cell death, probably through an apoptotic-based mechanism. Previous data obtained in the research group where this PhD Thesis has been carried out suggest that selenoureas can act as glutathione peroxidase (GPx) mimetics, being GPx a natural antioxidant system for removing hazardous peroxides. In this PhD Thesis a series of N,N′-diarylselenoureas has been prepared and evaluated as GPx mimetics in order gain a deeper understanding of the mode of action. Hammett plots of the rate of removing the ROS depending on the substituents in the aryl ring, together with molecular modelling, have allowed to propose a catalytic cycle for this antioxidant activity. A wide family of organocalcogens derivatives of hydroxytyrosol (HT), a potent natural antioxidant present in olive tree, has also been prepared: disulfides, diselenides and selenocyanates, the nature and length of the spacer being also modified, as well as the presence of free or protected phenolic hydroxyls. In the optimized struture, a diselenide derived from 4,4′-diselenobisbutyric acid and protected HT as methylidene acetal, GI50 values were found within the submicromolar range for all the tumor cell lines tested, and a 38-fold increase selectivity compared to the non-tumor cells were obtained. In coumarin derivatives, a clear influence of the nature of organoselenic function on biological activity was observed with a more potent antiproliferative activity (within the low micromolar range) founded for selenoureas than for the corresponding selenocarbamates. An increased level of ROS in the tumor cells was also observed, what suggests that probably coumarin-based selenoderivatives might exert a pro-oxidants activity as one of the potential modes of action, in a similar manner to the activity observed for O-methylnorepinefrine-based selenoderivatives. In silico calculations made it possible to predict that coumarin-selenoderivatives could behave as good inhibitors of histone deacetylase-8, a therapeutic target in the search for new antitumor agents; this observation was demostrated with in vitro tests, particularly for a dimeric selenourea derived from coumarin. Furthermore, selenocoumains did not act as P-glycoprotein substrates, responsible for drug resistance of the tumor cells where it is overexpressed as a detoxification pathway, so that drugs based on this structure would not generate resistance in its use in chemotherapy. Due to the interesting biological properties exhibited by hydroxytyrosol and many of its derivatives, in the second chapter, "Ethers and thio derivatives from protocatechuic alcohol", the preparation of derivatives of protocatechuic alcohol (3,4-dihydroxyphenylmethanol), an analogue of hydroxytyrosol, with a shorter alkyl chain was carried out. Thus, the reaction of protocatechuic alcohol with linear aliphatic alcohols of variable chain lenghs, (C1C18, including mono and di-unsatuated alcohols, oleic and linoleic alcohols) in the presence of resin IR-120(H+) as a heterogeneous acid catalyst furnished the corresponding alkyl/alkenyl ethers; the influence of hydrophobic/ hydrophilic balance in biological activity was analysed. The antiproliferative studies showed a clear influence of the length of the chain; thus, short lengths showed moderate activities, which improve (particularly for line SW1573, lung) with the chain length up to dodecanol, which exhibits activities in the low micromolar interval for all lines, and submicromolar for SW1573. An excellent selectivity is also achieved with respect to the non-tumor cell line (human fibroblasts BJ-hTert), which for the SW1573 ones was found to be 210-fold. Acetylation of the phenolic hydroxyls led to compounds which also show good activity. Additionally, symmetrical sulfides and disulfides, as well as thiols derived from protocatechuic alcohol were prepared with a similar synthetic approach (acid catalysis). An important influence on the antiproliferative activity of the length of the spacer connecting the phenolic fragments in the sulfides and disulfides was observed; the most active compound was the symmetric disulfide derived from the protocatechuic alcohol (within the low micromolar range), with an improvement of up to 17-fold with respect to the disulfide derived from HT, previously synthesized in our research group. The third chapter, entitled "Chemosenzymatic sulfation of tyrosol, hydroxytyrosol and its acetylated derivatives" was developed during a three-month stay (2017) at the Institute of Microbiology of the Prague Academy of Sciences, under the direction of Professor Vladimír Krên, where bacterial aryl sulphate transferase (AST) of Desulfitobacterium hafniense was used as a biocatalyst for the sulfation of some of the natural phenols present in the olive tree. These sulfate derivatives are compounds of great interest since they are naturally generated in the metabolism of phenols once ingested, being difficult to obtain by conventional chemical syntheses. In these sulfations, a chemoselectivity towards the aromatic hydroxyl groups has been observed, so that the protection of the aliphatic hydroxyl groups can be avoided, thus allowing the preparation of the sulfated metabolites in a single step. A slight preference for the enzyme towards the aromatic hydroxyl of position 3 of hydroxytyrosol, and to that of position 4 in hydroxytyrosol-2′-acetate was observed. The decrease in the reducing properties, free radical scavenging and anti-lipoperoxidation activities of the monosulfated compounds was also observed. In the fourth chapter the search for alternatives to conventional methods for extracting phenolic compounds from a medicinal plant and from olive leaves was performed. Part of this chapter entitled "Extraction of phenolic compounds with natural deep eutectic solvents (NADES). Preparation of a functional food", was developed during a three-month stay (2016) at the University of Leiden (Netherlands) under the direction of Professor Young Choi. In this stay, a novel methodology was used, encompassed in the so-called Green Chemistry, which consists in the use of NADES for the extraction, isolation, identification and quantification by HPLC of a series of flavonoids present in the Chinese medicinal plant Scutellaria baicalensis, such as scutellarin, scutellarein, baicalin, baicalein, oroxilinoside, wogonoside, wogonin and oroxylin A. These compounds present promising applications in the pharmacological, cosmetic and food areas, since they are known for their remarkable biological properties. In addition, an alternative to the conventional extraction method of olive phenols, generally based on extractions with hydro-alcoholic mixtures, was developed, which is based on the use of edible NADES for the isolation of the oleuropein present in the olive leaf.