Regulación de la funcionalidad de k-ras4b por unión a cam y fosforilación de la ser 181

Resumen

A partir de los resultados previos de nuestro grupo, para la realización de esta tesis nos planteamos estudiar la interacción entre K-Ras y CaM, con el objetivo de generar un mutante de K-Ras que no uniese CaM y nos permitiera determinar la función que ejerce CaM sobre esta GTPasa. Definimos tres regiones de interacción entre estas dos proteínas, la región hipervariable de K-Ras, la ¿-hélice 5 y el Switch II. Los distintos mutantes generados nos permitieron determinar que la interacción directa con CaM no alteraba la distribución celular de K-Ras y que éste seguía localizándose en la membrana plasmática. En 1987 se describió que K-Ras podía ser fosforilado, apuntando que podría ser en la Serina 181. Generamos una construcción que mimetizara esta fosforilación y observamos que no podía unirse a CaM. Muchas proteínas como MARCKS, p21cip1 o EGFR sufren una regulación dual por la fosforilación y la unión a CaM. Es decir, CaM y la fosforilación juegan papeles antagónicos, de manera que la fosforilación impide la unión a CaM y CaM evita la fosforilación de dichas proteínas. Quisimos comprobar si esta era la función que estaba ejerciendo CaM sobre K-Ras y efectivamente corroboramos esta hipótesis. Una vez demostrado que CaM inhibe la fosforilación de K-Ras y que la fosforilación impide la unión a CaM, nos propusimos determinar la función de la fosforilación en la Serina 181 sobre la actividad de K-Ras, y demostramos que: -La fosforilación induce la activación de K-Ras. -El mutante no fosforilable presenta una cinética de activación menos sostenida a lo largo del tiempo. -Este efecto se debe a que la fosforilación disminuyes la capacidad de las GAPs para hidrolizar el GTP de K-Ras. -La señalización celular mediada por K-Ras también se ve alterada por esta fosforilación, ya que la imposibilidad de fosforilar a K-Ras disminuye la activación de la vía PI3K/AKT a bajas concentraciones de mitógenos. -Estas diferencias en el perfil de activación son importantes para la correcta proliferación celular, ya que si no se puede fosforilar, las células disminuyen su capacidad de proliferación en un 50%, siempre y cuando la presencia de estímulos no sea saturante, es decir a bajas concentraciones de factores de crecimiento. -La fosforilación, al igual que la unión a CaM, no altera la distribución intracelular de K-Ras. -La fosforilación también modula la funcionalidad de la forma oncogénica de K-Ras: - Estimula la capacidad transformante. - Estimula la movilidad celular. - Estimula la supervivencia celular al daño en el DNA. - Estimula la proliferación y supervivencia a bajas concentraciones de factores de crecimiento, ya que tras dos días de deprivación las células que expresan K-Ras oncogénico o K-Ras oncogénico pseudo-fosforilado proliferan, pero si expresan la forma no fosforilable no sólo no proliferan, sinó que se mueren. Debido a una insuficiente activación del avía Raf/MEK/ERK y la vía PI3K/AKT. Finalmente, hemos iniciado un estudio de cómo la fosforilación puede alterar a la distribución de K-Ras en la propia membrana plasmática. Y hemos observado que a bajas concentraciones de factores de crecimiento, si K-Ras no se puede fosforilar presenta un difusión lateral más elevada, comparable a la que se obtiene en condiciones de quiescencia, mientras que la forma fosforilable ha enlentecido esta difusión lateral, asemejándose más a la movilidad obtenida en condiciones de estimulación total. Todos estos resultados indican que la fosforilación de K-Ras modula la actividad de esta GTPasa., tanto de la forma salvaje, como de la forma oncogénica. Y que esta fosforilación es esencial en condiciones de estimulación no saturantes para la correcta proliferación, movilidad y supervivencia celular.