Evaluation of different feeding strategies and their influence on the intestinal fermentative processes for the control of salmonella in pigs

Laburpena

La presente tesis fue ideada con el objetivo de encontrar estrategias alimenticias efectivas para el control de Salmonella en credos. La hipótesis fue que mediante la manipulación de la alimentación sería posible influenciar el crecimiento y la actividad fermentativa de la microbiota comensal intestinal y que estos cambios producidos en el ambiente intestinal afectarían a la supervivencia de Salmonella. Para probar esta hipótesis, se llevaron a cabo cinco estudios: El estudio I se realizó con el objetivo de investigar si la retirada del alimento en granja y la espera en matadero previos al sacrificio tienen alguna influencia sobre el peso del tracto gastro-intestinal (TGI) y sobre la actividad fermentativa de la microbiota y números de Enterobacteriaceae y lactobacilli en el ciego de cerdos finalizadores. En la granja, el alimento se retiró de los comederos 2 ó 12 horas antes de la carga en el camión de transporte y en el matadero, los cerdos fueron sometidos a esperas de 0, 5 ó 10 horas. El aumento en las horas de retirada de alimento y de espera en matadero influenció el peso del TGI (disminuyó) el pH (aumentó) la cantidad (disminuyó) y el perfil de ácidos grasos volátiles de cadena corta (disminuyó el butírico y aumentaron el valérico y los ácidos grasos ramificados (AGR) y las cantidades de NH3 (aumentaron). Los contajes de lactobacilli disminuyeron con el aumento en las horas de espera en matadero, mientras que los de Enterobacteriaceae aumentaron con las mayores horas de retirada de alimento y de espera en matadero. Aunque el aumento en las horas de retirada de alimento y de espera en el matadero disminuyó el peso del TGI, lo que podría facilitar el manejo de las vísceras en el matadero, condujo al aumento en los números de Enterobacteriaceae, probablemente debido a los cambios generados en el ecosistema microbiano intestinal promovidos por los cambios en el patrón fermentativo. Estos aumentos en Enterobacteriaceae podrían representar un mayor riesgo de contaminación de las canales por enteropatógenos de este grupo como Salmonella en caso de rotura de las vísceras en el matadero. En el estudio II se investigó la influencia de diferentes horas de retirada de alimento previas al sacrificio además de sobre los mismos parámetros que en el Estudio I, sobre la excreción fecal de Salmonella. Para ello se realizaron dos pruebas, una bajo condiciones experimentales (Prueba 1; 18, 30 y 36 horas) y la otra bajo condiciones comerciales (Prueba 2; 15 y 30 horas). El aumento en las horas de retirada de alimento influenció el peso del TGI, el cual tendió a disminuir (Prueba 1) o disminuyó ligeramente (Prueba 2). También influenció el pH cecal (aumentó), la cantidad (disminuyó) y el perfil de ácidos grasos volátiles de cadena corta (disminuyó el butírico y aumentaron el valérico y los AGR) bajo condiciones experimentales y comerciales. En la Prueba 2, conforme las horas de retirada de alimento aumentaron, disminuyeron los contajes de lactobacilli en ciego mientras que los de Enterobacteriaceae tendieron a aumentar, así como los cerdos Salmonella positivos en heces. De nuevo, el aumento en las horas de retirada de alimento previo al sacrificio indujo cambios en el ecosistema microbiano intestinal. Estos cambios podrían estar envueltos en la tendencia al aumento de Enterobacteriaceae en el ciego y de Salmonella en heces, representando un mayor riesgo de contaminación de la canal en caso de rotura de las vísceras en el matadero. Los estudios III y IV investigaron in vitro la influencia de la disponibilidad de diferentes tipos de carbohidratos fermentables sobre la actividad fermentativa de la microbiota y sobre la supervivencia de Salmonella Typhimurium en el intestino de los cerdos. En el estudio III, los carbohidratos fermentables fueron distintas fuentes de fibra dietética. Efluentes ileales liofilizados obtenidos de cerdos canulados alimentados con las dietas experimentales (dieta estándar basada en maíz como control, la misma en la que el maíz estaba molturado de manera gruesa, o la estándar en la que parte del maíz se sustituyó con pulpa de remolacha (8%), salvado de trigo (10%) o una mezcla de pulpa y salvado (8% y 10%) fueron usados como sustratos en las incubaciones in vitro. Estos sustratos promovieron cambios en la fermentación intestinal. Las dietas que incluían pulpa de remolacha aumentaron la producción de gas comparado con el resto de las dietas. Los valores medios de ácidos grasos volátiles de cadena corta a lo largo de toda la incubación fueron mayores para las dietas que contenían fibra que para la dieta sin fibra, con mayores ratios molares de acético y menores de propiónico, valérico y AGR. Los ratios molares de acético y AGR fueron significativamente los mayores y menores respectivamente parlas dietas que incluían pulpa de remolacha. La mezcla de fibras disminuyó las concentraciones de NH3 y aumentó las concentraciones de bases púricas. Sin embargo, todos estos cambios en la fermentación intestinal promovidos por la inclusión de diferentes ingredientes fibrosos y de maíz gruesamente molido no fueron suficientes para inhibir por sí mismos el crecimiento de Salmonella Typhimurium in vitro. En el estudio IV, los carbohidratos fermentables fueron distintos prebióticos: xylooligosacáridos (XOS), una mezcla de fructooligosacáridos/inulina (FIN), fructooligosacáridos (FOS), gentiooligosacáridos (GEO) y lactulosa (LAC). La estimulación del crecimiento de especies de Bifidobacterium y Lactobacillus fue demostrada en cultivos puros. Cuando estos prebióticos fueron incubados en sistemas batch, influenciaron los parámetros fermentativos estudiados (ácido láctico, cantidades y perfiles de ácidos grasos volátiles de cadena corta); sin embargo, menores cambios se observaron en los parámetros analizados cuando las incubaciones fueron llevadas a cabo en presencia de Salmonella Typhimurium SL 1344. También se cuantificaron cambios en determinadas poblaciones bacterianas (las teñidas con las sondas DAPI, Ato291, Bif164, Bac303, Chis150, Erec482, Lab158, Prop853, Rbro730 yRfla729) y Salmonella (sonda Sal303) mediante FISH. Todos los prebióticos aumentaron los contajes de Bif164 comparados con el control y todos menos FOS, los contajes de Lab158. Los contajes de Sal303 aumentaron durante la fermentación de todos los prebióticos comparados con el control, aunque entre ellos, el que menor crecimiento provocó fue LAC. Bajo las condiciones experimentales usadas, los prebióticos utilizados estimularon la actividad fermentativa intestinal, indicado por los cambios en los productos de fermentación y en las poblaciones bacterianas. Sin embargo, sólo la fermentación de LAC pareció ejercer algún efecto inhibitorio sobre Salmonella comparado con el resto de prebióticos estudiados. Finalmente, el estudio V investigó in vivo la influencia de la inclusión en la dieta de un carbohidrato fermentable (lactulosa, 1%) y de la adición de productos de fermentación (una mezcla de 0.4% ácido fórmico y 0.4% ácido láctico) sobre el ecosistema microbiano intestinal y la supervivencia de Salmonella Typhimurium en cerdos inoculados con Salmonella experimentalmente. En los contenidos de íleo y ciego fueron analizadas las cantidades de ácido láctico, fórmico y ácidos grasos volátiles de cadena corta (también perfiles) y en los contenidos de ciego además se cuantificaron cambios en poblaciones bacterianas (las teñidas por las sondas Bif164, Bac303, Erec482, Lab158, Prop853, Rbro730 y Rfla729) y Salmonella (sonda Sal303) mediante FISH y también cambios cualitativos mediante DGGE. Los tratamientos modificaron solo ligeramente los contajes de algunos de los grupos bacterianos analizados con FISH. Los resultados de DGGE no mostraron ninguna influencia de los tratamientos. Los productos de fermentación fueron apenas modificados por los tratamientos. Ninguno de los tratamientos redujo los números de Salmonella Typhimurium en los cerdos. Los resultados obtenidos en la presente tesis indican que la mayoría de las estrategias estudiadas son capaces de influenciar el crecimiento y la actividad fermentativa de la microbiota comensal del intestino de los cerdos e indican que la fermentación puede ser potencialmente modulada en un sentido beneficioso para la salud del animal. Sin embargo, solo el manejo de las horas de ayuno mostró un claro efecto de los cambios en el ambiente intestinal sobre la supervivencia del Enterobacteriaceae y Salmonella. A pesar de la observada falta de efecto inhibitorio sobre Salmonella del resto de estrategias estudiadas, serían necesarios más estudios para descartarlas, teniendo en cuenta las posibles limitaciones de las metodologías usadas y los resultados positivos encontrados en la literatura.