Caracterització d'una nova proteïna de Solanum tuberosum, PHOR1, involucrada en la via de senyalització de les giberel.lines

Resumen

Les giberelines bioactives (GAs) modulen moltes respostes durant el creixement i desenvolupament de les plantes, inclosa la germinació de les llavors, l'expansió de les fulles, l'elongació de la tija, la iniciació de la floració i el desenvolupament del fruit i la llavor. Un altre procés controlat per les GAs és la tuberització a les patateres. En la formació de tubercles, que es troba fortament influenciada pel fotoperiode, està descrit que les GAs tenen un clar efecte inhibidor de la tuberització. La tuberització és en general induïda pels fotoperiodes de dies curts (SD), en algunes especies de patatera però els dies curts són un requisit per a que formin tubercles, com a Solanum demisum i algunes línies de Solanum tuberosum ssp. andigena. Aquestes espècies només tuberitzen en condicions de dies curts i no tuberitzen en condicions de dies llargas (LD) o SD suplementat amb un "night-breack" (SD+NB). Tractaments amb inhibidors de la biosíntesi de les GAs, ancimidol o paclobutrazol, poden promoure la tuberització en aquestes plantes en condicions no inductores de LD. La sobreexpressió o la inhibició de l'expressió del gen biosintétic GA 20-oxidasa StGA20ox1, en les plantes de patatera d'andigena transgèniques presenten una tuberització en condicions de SD retardada i primerenca, respectivament. Aquestes dades estableixen una possitiva correlació entre la disminució de l'activitat de les GAs i la inducció de la tuberització en aquestes plantes. Més evidències del paper de les GAs en la inhibició de la formació de tubercles en condicions no inductures es va posar de manifest al aïllar un mutant d'andigena, ga1, que presenta un bloqueix en la biosíntesi de les GAs i que pot tuberitzar, després de moltes setmanes, en LDs. Aquestes observacions poden ser interpretades com indicatives de que les dos vies regulatòries independentes controlen la inducció de la tuberització, la via del fotoperiode i la via de les GAs, en el que la disminució en la biosintesi i/o el transport de les GAs als estolons o una reducció en la resposta a les GAs poden estar regulats per la inducció fotoperiòdica. Utilitzant RT-PCR "differential display" de fulles de plantes crescudes en condicions inductores i no inductores (SD+NB), hem aïllat un clon anomenar PHOR1 (per photoperiod responsive 1) que codifica per una proteïna homòloga al domini "arm-repeat" de la proteïna de segmentació polaritzada armadillo de Drosophila. L'expressió del gen de PHOR1 oscil.la amb un ritme diurn, que en plantes induïdes per a la tuberització presenten dos pics del transcrit. La inhibició antisentit de l'expressió de PHOR1 a les plantes transgèniques produeixen un fenotit semi-nan similar al de les plantes deficients en GAs. Les línies transgèniques pel gen PHOR1 presenten internodes curts, una reducció en la llargària dels pecíols i fulles de color verd fosc i en condicons de SD tuberitzen abans que les plantes control. Les curves de dosi resposta a l'aplicació de GAs exògenes demostresn que les línies trangèniques antisentit presenten una disminució en la resposta, vers un increment de la reposta a les GAs en les plantes transgèniques que sobreexpressen la proteïna PHOR1. La mesura dels nivells endògens de GAs evidencien un increment d'aquests en les plantes transgèniques amb nivells reduïts de PHOR1. Una altre evidència de l'implicació en la resposta de les GAs, és el resultat dels anàlisis Northern que confirmaven que la regulació per "feedback" dels nivells dels tràncrits de la GA 20-oxidasa i la GA 2-oxidasa estaven alterats a aquestes línies. Estudis de localització subcel.lular utilitzant una expressió transitòria de la proteïna fusionada a la GFP mostraren que les GAs indueixen una ràpida migració de la proteïna de fusió PHOR1-GFP del citoplasma al nucli de la cèl.lula. Aquests resultats indiquen que PHOR1 és un component de la via de transducció de senyal de les GAs, que media la inducció de la via de les GAs mitjançant la seva localització nuclear. Bioactive gibberellins (GAs) modulate many responses during plant growth and development, including seed germination, leaf expansion, stem elongation, flower initiation and seed and fruit development. Another well documented plant developmental process controlled by GAs is tuberization in potato. Tuber formation is strongly influenced by day length, with GAs reported to have an inhibitory effect on tuber induction. Tuberization is in general promoted by short-days (SD), with short photoperiods being an absolute requirement for tuber formation in some wild-species of potato, like Solanum demissum or some lines of S. tuberosum ssp. andigena. These species tuberize only in SD conditions, and do not produce tubers when grown in long-days (LD) or SD supplemented with a night-break (SD+NB). Treatments with the inhibitors of GA-biosynthesis, ancymidol or paclobutrazol, are able to promote tuberization of these plants under non-inductive LD conditions. Over-expression or antisense inhibition of the GA 20-oxidase StGA20ox1 gene in transgenic potato andigena plants results in, respectively, delayed or early tuberization under SD conditions. Therefore, these data establish a positive correlation between decreased GA activity and tuber induction in these species. Strong evidence for a role of GAs in inhibition of tuber formation under non-inductive conditions derives also from the observation that the andigena ga1 mutant, blocked in GA biosynthesis, can form tubers after several weeks in LDs. These observations can be interpreted as indicative of two independent regulatory pathways controlling tuber induction, i.e. a photoperiod pathway and a GA pathway, with a decrease in GA synthesis and/or transport to the stolons or a reduced responsiveness to GAs being able to partly overcome the requirement for photoperiodic induction. Using RT-PCR differential display of leaves from plants grown under inducing (SD) and non-inducing (SD+NB) conditions, we have isolated clone PHOR1 (photoperiod responsive 1) encoding an arm-repeat protein with homology to the Drosophila segment polarity protein armadillo. Expression of the PHOR1 gene oscillates with a diurnal rhythm that, in plants induced for tuberization, is characterized by two peaks of transcript around dawn and dusk. Antisense inhibition of PHOR1 expression in transgenic plants produces a semi-dwarf phenotype similar to GA-deficient plants. The antisense PHOR1 lines exhibit shorter internodes, reduced petiole length and broader leaves, and under SD conditions tuberize earlier than controls. Dose-response curves to exogenous GA showed that GA-response is reduced in the antisense lines, while an enhanced response to GAs is detected in transgenic lines over-expressing the PHOR1 protein. Measurements of endogenous GA levels evidenced that GA content is increased in the antisense plants with reduced levels of PHOR1 expression. As evidence of an impaired GA response, northern analyses confirmed that feedback regulation of the GA 20-oxidase and GA 2-oxidase transcripts was altered in these lines. Subcellular localization studies using a translational fusion to GFP showed that GAs induced a rapid migration of the PHOR1-GFP fusion protein from the cytoplasm to the nucleus. These results indicate that PHOR1 may function in GA signal transduction by mediating nuclear signalling of the GA-induced pathway.