Clonaje y caracterización de nuevas e IF2[alfa] quinasas reguladas por hemina

Abstract

La regulación de la expresión génica al nivel de la síntesis de proteínas ocurre principalmente durante la fase de iniciacón. En la fase de iniciación de la traducción intervienen una serie de factores proteicos denominados factores de iniciación o eIFs. Uno de ellos es el eIF2 cuya fosforilación en el residuo Ser51 de su subunidad a tiene como consecuencia la inhibición de la sintesis general de proteinas. Existen cuatro tipos de eIF2a quinasas que se activan en diferentes condiciones de estrés celular. Una de estas eIF2a quinasas es el HRI (inhibidor regulado por hemina) que ha sido caracterizado en reticulocitos de conejo y se activa a bajas concentraciones de hemina. En esta tesis se ha purificado una actividad eIF2a quinasa inhibible por hemina a partir de extractos de hígado de ratón. También se clonó el HRI de raton (mHRI) y se demostró mediante anticuerpos específicos que la actividad eIF2a quinasa antes descrita corresponde al mHRI. Mediante coexpresión de los mHRIs silvestre y mutante K196R en células de mamífero 293, y fusionados a dos epítopos distintos (HA y FLAG), se demostró que el mHRI forma in vivo homodímeros, que el mHRI se expresa en una gran variedad de tejidos y en células NIH-3T3. También se purificó y caracterizó una actividad inhibidora de eIF2a quinasas (MKI) a partir de los extractos de hígado de ratón. Se ha clonado y caracterizado las dos primeras eIF2a quinasas procedentes de la levadura Schizosaccheromyces pombe, SEK1 y SEK2, que guardan gran similitud con el HRI de mamiferos. Las proteinas recombinantes fosforilan especificamente la Ser51 del eIF2a. La actividad eIF2a quinasa de SEK1 y SEK2 se inhibe por hemina a pesar de carácter de los motivos de regulación por hemina (HRM1 y HRM2) descritos en el HRI.SEK1 parece estar regulada en S. Pombe por proteinas de choche térmico. Por ultimo, se hizo un analisis mutacional de mHRI en el que se comprobó que los HRMs y las regione