Procesos moleculares implicados en los pasos iniciales de la síntesis de los ribosomas humanos

Resumen

La síntesis de ribosomas es un proceso complejo en el que la transcripción, modificación, plegamiento y procesamiento del precursor del rRNA (pre-rRNA) se tienen que coordinar para dar lugar a la formación de las subunidades ribosómicas maduras. Este proceso es asistido por más de 200 factores de biogénesis de ribosomas (RBFs) que, junto con el pre-rRNA y las proteínas ribosómicas, van conformando diferentes complejos pre-ribosómicos. Estos complejos migran desde el nucleolo al citoplasma a medida que van madurando. En células humanas, la información disponible acerca de la composición de los pre-ribosomas, sobre todo la que se refiere a aquellos que son nucleolares y más iniciales, es muy escasa debido a que existen limitaciones técnicas para poder analizarlos bioquímicamente. Esto se debe a que las partículas pre-ribosómicas más tempranas son producidas en regiones internas del nucleolo que tienen una alta viscosidad, lo cual dificulta su extracción. La primera parte de esta tesis se centra en la generación de herramientas y el desarrollo de métodos de extracción que permitan caracterizar a los pre-ribosomas nucleolares tempranos de células humanas. Primero, se realizó una validación del método de extracción PSE y se generaron líneas celulares que expresan endógenamente un RBF fusionado a la GFP, para utilizarlo como cebo de purificación de pre-ribosomas tempranos por cromatografía de afinidad. Seguidamente, utilizando esas herramientas en combinación con análisis composicionales por espectrometría de masas y experimentos de sedimentación en gradientes de sacarosa, se comprobó que la composición del subcomplejo pre-ribosómico UTP-B y que la función de la proteína UTP14A están conservados en células humanas y células de levadura. En la segunda parte de la tesis se realizó un estudio de caracterización funcional de la proteína RRP8, la metiltransferasa que introduce la modificación m1A1322 en el rRNA 28S. La identificación de RBFs que interaccionan con RRP8 y la caracterización del fenotipo inducido por su silenciamiento o eliminación total evidenciaron que esta proteína forma un módulo con un RBF de la subunidad 40S que se une y es importante para la producción eficiente del pre-ribosoma bipartito, el intermediario inicial que contiene todavía unidos los precursores prematuros de la subunidad pequeña y de la subunidad grande. Aunque la pérdida de RRP8 es bien tolerada por células transformadas en cultivo, no lo es en células no transformadas, lo cual revela que su función es esencial en algunos tipos celulares.