Genome Mining of the Strain Streptomyces sp. CA-170360: Identification and Heterologous Expression of Secondary Metabolite Biosynthetic Gene Clusters

Resumen

La aparición de cepas patógenas resistentes a antibióticos, especialmente bacterias Gramnegativas, ha aumentado enormemente en los últimos años, comprometiendo la eficacia de los antibióticos usados hasta el momento. Por ello, la búsqueda de nuevas moléculas con actividad antimicrobiana se ha convertido en una tarea indispensable. Históricamente, los actinomicetos, sobre todo las especies del género Streptomyces, han sido una de las grandes fuentes de nuevos antibióticos. La cepa Streptomyces cacaoi CA-170360, perteneciente a la colección microbiana de Fundación MEDINA, produce una familia de nuevos ciclopentapéptidos, las pentaminomicinas A-H, junto con los ya conocidos antibióticos BE-18257, también ciclopentapéptidos, con una moderada actividad frente Acinetobacter baumannii. Esta cepa, además, produce cacaoidina, el primer lantipéptido de clase V (lantidina) descrito, con actividad frente a patógenos Gram-positivos, como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y Clostridium difficile. El genoma de esta cepa fue secuenciado y analizado, llegando a identificar las rutas biosintéticas responsables de la producción de ambas familias de compuestos, así como otras de rutas de biosíntesis de metabolitos secundarios ya conocidos y detectados en las fermentaciones de la cepa. Las pentaminomicinas A-H y los antibióticos BE-18257 son dos familias de ciclopentapéptidos sintetizados por dos sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS) independientes pero codificadas conjuntamente en la misma ruta biosintética (cpp). La ruta carece de un dominio tioesterasa necesario para la ciclación y liberación de los pentapéptidos, pero contiene una proteína aislada tipo PBP con un dominio beta-lactamasa conservado (CppA) aguas arriba de la primera NRPS. La expresión heteróloga de la ruta cpp en el hospedador Streptomyces albidoflavus J1074 confirmó que es la responsable de la biosíntesis tanto de las pentaminomicinas A-H como de los antibióticos BE-18257, y la generación del mutante por reemplazamiento génico del gen cppA demostró su implicación en la liberación y ciclación de ambas familias de pentapéptidos. La cacaoidina es un nuevo lantipéptido glicosilado con unas características estructurales no descritas hasta el momento, como un número inusualmente elevado de D-aminoácidos, un anillo de lantionina dimetilado (NMe2Lan), no encontrado en otros lantipéptidos, y una O-glicosilación de un residuo de tirosina con un disacárido no descrito hasta la fecha en ningún otro producto natural, formado por α-L-ramnosa y β-L-6-deoxigulosa. Las diferentes herramientas predictivas disponibles no fueron capaces de identificar la ruta biosintética responsable de la producción de cacaoidina, que se localizó usando la secuencia C-terminal de aminoácidos y encontrando el gen estructural en el genoma. Finalmente, la ruta cao se delimitó mediante análisis BLAST y de predicción de estructuras secundarias HHPred. Su expresión heteróloga en S. albidoflavus J1074 confirmó que es la ruta responsable de la producción de cacaoidina y llevó a la identificación de una nueva variante de cacaoidina, glicosilada con un disacárido diferente que tiene dos átomos menos de oxígeno (cacaoidina-2O). La generación de mutantes en el hospedador heterólogo nos permitió asignar las funciones de diferentes genes en la biosíntesis de cacaoidina: el gen cao4 participa en la doble metilación del residuo de Ala en el extremo amino-terminal, y los genes cao8 y cao16 son dos glicosiltransferasas que trabajan de forma cooperativa en la glicosilación del residuo de Tyr. Finalmente, la generación de aglicón se consiguió mediante la hidrólisis ácida controlada de cacaoidina-2O.