Alternativas y reducción del uso de antibióticos en el ganado porcino

Resumen

Tradicionalmente el mal uso de los de antibióticos como promotores de crecimiento, así como su abuso profiláctico y metafiláctico ha llevado a las bacterias resistentes frente a antibióticos a una posición muy crítica para la salud humana y la sanidad animal. Por ello, las autoridades correspondientes a nivel nacional e internacional han diseñado diversos planes de control y vigilancia de este fenómeno, reduciendo en gran medida el uso de antibióticos. Las explotaciones ganaderas, más concretamente las intensivas de porcino, han empezado a realizar la transición para lograr la disminución de uso de los antibióticos, y también para que estas medidas afecten lo menos posible en la salud de los cerdos y a en los índices de producción. Para un conocimiento adecuado de las resistencias frente a antibióticos es fundamental estudiar el perfil de resistencias del microorganismo. Por ello, el aislamiento, identificación y perfil de resistencia de los microorganismos es un aspecto clave como estrategia para el control y tratamientos adecuados. Por otro lado, la bioseguridad en las granjas es otro de los aspectos que se deberían tener en cuenta, puesto que cuanto mejor es la limpieza y desinfección más probabilidad existe de cortar los ciclos de contagios entre lotes. Además, un ambiente más limpio mejora la salud general de los animales, previniendo la propagación de los microorganismos patógenos. Por último, el uso de aditivos alimentarios como antimicrobianos y moduladores de la microbiota está cada vez más en auge, como medidas alternativas al uso de antibióticos. Por todo lo anterior, en la presente Tesis Doctoral se ha abordado este problema desde los diferentes perspectivas. La identificación de las especies bacterianas aisladas de muestras de origen respiratorio se realizó mediante PCR y MALDI-TOF, obteniendo 60 cepas de Streptococcus suis, 48 de Pasteurella multocida, 18 de Actinobacillus pleuropneumoniae, y 5 de Glaesserella parasuis También se estudió el perfil de resistencia a los antibióticos. Las resistencias de A. pleuropneumoniae y G. parasuis se estudiaron mediante antibiogramas de disco. A. pleuropneumoniae fue sobre todo resistente a trimetroprima-sulfametoxazol y eritromicina, con un 61,1 % de aislados resistentes en ambos casos. Para Glaesserella parasuis se obtuvieron resistencias sobre todo para tetraciclina y ampicilina, con un 60 % de los aislados. Por otro lado, S. suis y P multocida fueron estudiados mediante el método SensititreTM. Para P. multocida se obtuvieron resistencias mayoritariamente para las lincosamidas (en un 94,4 % de los casos resistentes a clinfamicina). Para las sulfaminas y tiamulina se obtuvo un 55,5 % de aislados resistentes, y para resto de los antibióticos probados se registró sensibilidad en al menos el 50 % de los aislados. Las proporciones más elevadas de resistencia entre los aislados de S. suis se observaron en las tetraciclinas con un 95 % y 93,3 % para la clortetraciclina y oxitetraciclina, respectivamente. Además, en el caso de las dos especies bacterianas más prevalentes se realizó el estudio de genes, tanto de resistencia frente a antibióticos como de factores de virulencia. Respecto a los factores de virulencia, S. suis presentó un 6,7 % de los aislados positivos frente al gen epf; un 58,3 % positivos para el gen mrp, un 43,3 % para el gen sly, un 76,7 % para el gen luxS y un 53,3 % para el gen gapd. El gen más encontrado en estos aislados fue el luxS, presente en un 76,6 % de los aislados. Estudiando a P. multocida observamos que el total de los aislados fue positivo para el gen oma87, (48 aislados). Los genes hgbA, nanH, ompH, ptfA y sodA lo fueron en el 95,8% seguidos por el gen tonB, con un 83,3 % de casos positivos. Los genes menos prevalentes fueron el toxA, con un 27,1% de los aislados, el pfhA, con un 10,4%, y por el tbpA, con únicamente un aislado positivo. Respecto a los genes de resistencia frente a antibióticos analizados en S. suis, de los cuatro estudiados, para las tetraciclinas el gen tetO estuvo presente en un 68,3 % de las bacterias, frente al tetM, presente únicamente en el 1,7 %. Para el estudio de los genes de resistencia frente a los macrólidos ermB se encontró en un 46,7 % de los aislados, del total, MefA/E estuvo presente en un 8,3 de los aislados. Para las resistencias frente a tetraciclinas, un 12,5 % de aislados fueron positivos frente al gen tetA, y un 39,6 % para tetB. Para la resistencia frente a β-lactámicos, el 27,1 % de los aislados presentaron el gen blaROB1 frente al 8,3 % de los aislados con blaTEM. Respecto a los macrólidos presentaron una resistencia de en 16,7 % para el gen ermA, del 41,7 % para el ermC, del 22,9 % para el msrE y de 0 % para el mphE. En relación con el estudio de la acción de los desinfectantes, con el fin de mejorar la bioseguridad, se realizaron ensayos tanto in vitro como en granja, así como también se probaron nuevos métodos de desinfección, como la ozonización. Se analizó la capacidad de los desinfectantes más comunes en granja sobre bacterias ambientales y del CRP concluyendo que los desinfectantes polimorfo y limoseptic no funcionaron con la misma eficacia que los demás probados. También se realizaron pruebas in vitro con ozono y agua ozonizada. Existió una reducción del 100 % en el número de colonias en los 100 litros de aire a 1,5 ppm de ozono: por ello, para las bacterias presentes en el aire resultó muy eficaz. Para esta concentración de ozono y con agua ozonizada en objetos de superficie irregular, la desinfección funcionó igual que el desinfectante convencional en comederos, bebederos y paredes, y mejor en el caso de las placas calefactoras, suelos y juguetes. Este hallazgo fue de gran interés, puesto que el ozono es un desinfectante que no deja residuos, siendo mejor para el medio ambiente. Tampoco necesita aclarado, mejorando así los tiempos de secado, lo que agiliza el tiempo de llenado con el siguiente lotes de cerdos. Teniendo en cuenta el uso de aditivos alimentarios como alternativa al uso de antibióticos, se realizaron estudios in vitro para evaluar la capacidad antibacteriana del ácido láurico, en bacterias Gram positivas y Gram negativas, realizándose determinaciones de la concentración mínima inhibitoria (CMI) para las bacterias S. suis y P. multocida. En estos ensayos se incluyeron métodos basados en la difusión (tanto en placa como en disco) para cuantificar la inhibición de las bacterias frente a estos compuestos. También se realizó un estudio de microscopía electrónica de barrido para observar el efecto del ácido láurico frente a S. suis. Los ensayos de difusión en placa no se pudieron llevar a cabo debido a las características físico-químicas del ácido láurico con el medio de cultivo, obteniéndose placas muy heterogéneas. Por otro lado, los métodos de difusión por disco sí se pudieron llevar a cabo sin ningún problema, obteniendo muy buenos resultados para el ácido láurico y monolaurina en el caso de ambas bacterias estudiadas y en concentraciones intermedias. Se estudiaron concentraciones desde 2,4 hasta 1500 mg/ml de ácido láurico o monolaurina al 5 %, obteniendo la inhibición para todas las concentraciones de ácido láurico en S. suis, y para P. multocida a partir de 40 mg/ml se obtuvieron inhibiciones del crecimiento bacteriano. Además; en el caso de S. suis, se realizó un estudio de microscopía electrónica de barrido, en el que se se pudo observar una disminución de la densidad bacteriana y cambios en su morfología al ser expuesto a 900 mg/ml de ácido láurico. Por último, se valoró en un ensayo experimental en granja el efecto de suplementación de la dieta con dos dosis diferentes de ácido láurico. Esta experiencia se llevó a cabo en la etapa de transición, sobre 144 lechones destetados (25 días de edad), que se distribuyeron en tres grupos (dos corrales por grupo). Todos los grupos recibieron piensos sin antibióticos ni óxido de zinc. Los animales del primer grupo recibieron pienso pre-starter y starter sin aditivo, el segundo grupo recibió pienso suplementado con 2 kg de ácido láurico por tonelada y el último grupo suplementado a 4 kg/T. Los valores de ganancia media diaria (GMD) durante los 43 días del experimento fueron muy similares en los tres casos, aunque algo más elevados en el grupo que recibió la dosis más alta de ácido láurico. El consumo de pienso fue más elevado en el grupo control (28,64 kg/cerdo), en comparación con los grupos que recibieron ácido láurico (grupo de 2 kg/T: 27,17 kg/cerdo y grupo 4 kg/T: 27,48 kg/cerdo). Finalmente, el índice de conversión mostró una leve mejoría (más pienso convertido en kilo productivo) en el grupo que recibió 4 kg/T (2,02) frente al grupo control (2,29). Las diferencias no alcanzaron significación estadística. Al estudiar la microbiota la riqueza de especies bacterianas fue más alta en el caso de la microbiota fecal, en comparación con la microbiota respiratoria, la cual fue incrementando su diversidad a lo largo del tiempo. El estudio de diversidad de especies se analizó mediante el índice de diversidad de Simpson, observando tanto las especies bacterianas en la microbiota como su abundancia relativa. En el caso de la microbiota fecal, este índice fue disminuyendo a lo largo del tiempo, por lo que se puede afirmar que las especies bacterianas fueron siendo más variadas a lo largo del tiempo. El índice de Simpson de la microbiota nasal fue aumentando a lo largo del tiempo, podemos decir que la diversidad de especies en este caso fue asentándose y disminuyendo a lo largo del tiempo. Para el análisis de los componentes principales del análisis de la microbiota nasal, se observó una segregación de las bacterias nasales en función de la edad de los cerdos, encontrando diferencias entre las especies. Respecto a la taxonomía fecal, se observó una segregación de las bacterias fecales, en función de la edad de los cerdos, entre el estadio final e inicial, pero no se observó diferencia clara entre el estadio intermedio y final. Las especies de las bacterias más abundantes en la microbiota nasal fueron Clostridioides difficile, que apareció mayoritariamente durante los dos primeros muestreos a los cerdos y Bergeyella zoohelcum, la cual apareció sobre todo en el primer y último muestreo. Las bacterias que aparecieron durante todo el muestreo, pero sobre todo tras los 43 días que duró el ensayo, fueron S. suis y G. parasuis. Por último, fueron identificados varios integrantes del género Prevotella y Moraxella durante todo el ensayo. Por otro lado, tras el análisis de la microbiota fecal obtuvimos diversos integrantes del género Prevotella, sobre todo en los lechones que llevaban consumiendo el pienso suplementado, tras los 14 días iniciales del experimento. La bacteria E. coli apareció en gran cantidad, sobre sobre todo al principio del experimento, por lo que luego podría haber sido desplazada por Prevotella. También se ha encontrado a Ruminococcus en cantidades destacadas, sobre todo en los lechones alimentados con la máxima dosis de ácido láurico. El género Clostridium fue variando a lo largo de tiempo, así como la especie Bacteroides frágilis.