Análisis molecular del transporte nucleocitoplasmático de ksr1

Resumen

KSR1 (Kinase Suppressor of Ras 1) es una proteína scaffold de la ruta Ras/Raf/MEK/ERK. KSR1 se localiza mayoritariamente en el citosol y se traslada a la membrana plasmática tras la activación de ERK1/2. Para este proceso es necesaria una de las cinco regiones conservadas de KSR1, el dominio CA3. En la presente Memoria hemos identificado una secuencia de localización nuclear en KSR1, a la que hemos denominado K-NLS, correspondiente a los residuos 383-PLARLRRTE-391. Esta secuencia, similar a la NLS de c-myc, resultó ser la responsable del transporte de KSR1 al núcleo, pues la sustitución de los residuos R386 y R389 por metioninas evitó la acumulación de KSR1 en el núcleo en experimentos de bloqueo de la exportación y causó la redistribución de un mutante nuclear (KSR1-Mut) en el citosol. Además, hemos observado una interacción entre KSR1 y componentes del sistema de transporte, en concreto las importinas ¿5, ¿7 y ß, y que el dominio CA3 era necesario. La adición de importinas ¿5 y ¿7 favoreció la acumulación in vitro de una fusión BSA-K-NLS en el núcleo de células HeLa permeabilizadas con digitonina, mientras que la mutación de la secuencia K-NLS redujo la interacción entre KSR1 e importinas ¿ in vivo. Finalmente, hemos determinado una correlación, entre la localización nuclear de KSR1 y el estado de activación de ERK1/2 tanto in vitro como in vivo. Tanto la estimulación con EGF y la sobreexpresión de ERK1 silvestre redistribuyeron a KSR1-Mut en el citosol, pero, sin embargo, un mutante de ERK1/2 quinasa inactivo fue incapaz de producir este efecto. Asimismo, mutaciones que mimetizaron la fosforilación de KSR1 por ERK1/2 redujeron la asociación entre KSR1 e importina ß. Muy notablemente, hemos detectado que KSR1 endógeno puede distribuirse tanto en el citosol como en el núcleo, aunque la localización de KSR1 en tejidos tumorales, caracterizados por una activación constitutiva de ERK1/2, es exclusivamente citoplasmática En conclusión, los resultados mostrados en la presente Memoria permiten establecer un nuevo modelo de regulación de KSR1 en el cual la fosforilación por ERK1/2 evita el transporte de KSR1 al núcleo, aumentando su concentración local en la membrana y favoreciendo una mayor activación de EKR1/2.