Implicación de los complejos TFIIH y FACT en el mantenimiento de la integridad del genoma

Zusammenfassung

Mantener la integridad genómica es esencial para garantizar una herencia fidedigna del material genético así como para asegurar el correcto funcionamiento de la célula. La inestabilidad genética se asocia con el envejecimiento, la tumorogénesis y muchas enfermedades genéticas. Por esta razón, en biomedicina es importante el estudio de las bases moleculares de su origen. En esta tesis abordamos el estudio de la inestabilidad genética asociada a defectos en los complejos FACT y TFIIH, en S. cerevisiae y células humanas. FACT (FAcilitates Chromatin Transcription) es un complejo chaperona de histonas formado por las subunidades Spt16/SPT16 y Pob3/SSRP1 (en levaduras/humanos, respectivamente). Su actividad en la reorganización de nucleosomas es necesaria para múltiples procesos que ocurren en la cromatina. Uno de ellos es la elongación de la transcripción, durante la cual FACT facilita el avance de la RNA polimerasa ayudando a mantener una correcta estructura de la cromatina. Otro proceso en el que FACT participa es la replicación. Este complejo fue aislado como componente del replisoma y está implicado en la progresión del mismo. Sin embargo, aún se desconoce si FACT tiene una función en el mantenimiento de la estabilidad de la horquilla replicativa. Nuestros resultados revelan que FACT es esencial para mantener la estabilidad genómica en levaduras y en células humanas, ya que su ausencia se asocia con altos niveles de recombinación así como formación de roturas en el DNA. Esta inestabilidad está asociada a defectos de replicación, los cuales tiene lugar principalmente en regiones transcritas. Esto se demuestra por la acumulación de la helicasa Rrm3 en mutantes de S. cerevisiae o por el hecho de que la inhibición de la transcripción suprime los defectos replicativos de células humanas carentes de FACT. Por lo tanto, estos datos ponen de manifiesto la importancia de FACT en prevenir las consecuencias negativas de las colisiones entre las maquinarias de replicación y la transcripción. Un elemento importante asociado a este tipo de colisiones es la formación cotranscripcional de R-loops, unas estructuras formadas por la hibridación del RNA naciente con la hebra molde de DNA, desplazando la no transcrita que queda como DNA de cadena sencilla. Los R-loops constituyen un obstáculo sustancial para la horquilla de replicación y se ha demostrado que su acumulación es una fuente de inestabilidad. Nuestros análisis indican que FACT es necesario para regular la acumulación de R-loops, ya que éstos se acumulan en su ausencia y la sobreexpresión de la RNasaH, que degrada estos híbridos de RNA-DNA, suprime parte de la generación de roturas. Estos datos nos permiten proponer un modelo en el que el complejo FACT tiene un papel clave en la resolución de colisiones entre la replicación y la transcripción, mediados o no por Rloops, y apoyan datos previos que sugieren una relación entre la formación de R-loops y una organización específica de la cromatina. Otra fuente importante de inestabilidad es la asociada con defectos en la reparación de daños en el DNA. En la célula existen varias rutas de reparación del DNA. La ruta NER es la encargada de reparar una amplia variedad de lesiones, incluido aductos, que provocan la distorsión de la doble hélice. El complejo TFIIH, tradicionalmente implicado en la iniciación de la transcripción, también es un factor clave para la reacción de NER. Esto explica que defectos en su funcionamiento se asocien con varias enfermedades hereditarias humanas, como la combinación de Xeroderma pigmentosum y el síndrome de Cockayne (XP/CS), cuya base molecular no está aún clara. En esta tesis hemos analizado el impacto de un tipo específico de mutaciones en la helicasa Rad3/XPD de TFIIH. En S. cerevisiae, estas mutaciones son denominadas rem descritas por asociarse con elevados niveles de recombinación y mutación y se localizan en el surco de union al ATP de Rad3. Las células rad3-102, caracterizadas previamente, realizan una reacción de NER incompleta. Sin embargo, son muy poco sensibles a UV. Esto es debido a que la reparación de aductos en el DNA se canaliza hacia la formación de roturas de doble cadena en el DNA durante la siguiente ronda de replicación. Nuestros resultados revelan que estas reacciones incompletas de NER ocurren en todos los mutantes rem analizados, en mayor o menor medida, a pesar de sus diferentes grados de sensibilidad a UV. Experimentos in vivo indican que la capacidad de unión y de liberación de TFIIH al DNA están disminuidas, lo que bloquea la finalización de NER. La recreación de la mutación rad3-102 en células humanas, así como las mutaciones asociadas con XP-D/CS, que también afectan al surco de unión al ATP de XPD, presentan fenotipos similares. En conjunto, nuestros resultados nos permiten proponer un modelo en el que la capacidad de TFIIH de abrir el DNA durante NER y su persistente acumulación en el DNA condicionarían la eficiencia de la reacción de NER y la restauración de la transcripción tras el daño. Todo ello podría ayudar a entender el fenotipo XP-D/CS. Finalmente, hemos extendido el estudio de la inestabilidad genómica asociada a defectos en TFIIH mediante la caracterización en levaduras de mutaciones en la otra helicasa del complejo, Rad25. Estos análisis indican que la reparación de aductos en mutantes deficientes de NER afectados en el núcleo de la helicasa Rad25 es preferentemente canalizada hacia una vía de reparación post-replicativa libre de errores, aspecto que necesitaría aún más investigación para poder entender el mecanismo implicado.