Inestabilidad genética y cambios en la cromatina en mutantes del complejo THO en mitosis y meiosis de eucariotas modelo

Resum

Inestabilidad genética y cambios en la cromatina en mutantes del complejo THO en mitosis y meiosis de eucariotas modelo Doctorando: Maikel Castellano Pozo Directores de tesis: Andrés Aguilera López y Tatiana García Muse Para el mantenimiento y el control de los procesos celulares, la integridad genética es un factor clave. Mutaciones o factores que alteren este control, conllevan a la inestabilidad del genoma, provocando defectos tanto a nivel celular como a nivel de organismo (Aguilera y Gómez-Gonzalez, 2008). Uno de los mecanismos clave para la integridad genética es la Transcripción, cuyos errores generan un incremento en las tasas de recombinación así como de mutación. THO es un complejo nuclear formado por 5 subunidades (Hpr1, Tho2, Mft1, Thp1, Tex1) que funcionan como una unidad estructural y funcional, juegando un papel clave en la biogénesis de las ribonucleopartículas, con una función principal llevada a cabo en la interfase entre la transcripción y el transporte del ARN mensajero (Strasser et al., 2002). El complejo THO se encuentra altamente conservado en eucariotas, aunque aún no había sido descrito en el nematodo C. elegans. En esta tesis hemos caracterizado una de las proteínas constituyentes del complejo THO en C.elegans, THOC-2, que posee un alto porcentaje de similaridad con Tho2 de levaduras y THOC-2 de humanos. Hemos observado que el complejo THO se encuentra conservado en el nematodo, siendo esencial para su desarrollo. Los mutantes THO son estériles, pero gracias a la contribución materna de ARNm mensajero en la descendencia, los nematodos mutantes THO llegan a desarrollarse hasta adultos, permitiendo estudiar la carencia de dicho complejo en tejidos adultos. Los mutantes THO, además de mostrar defectos en el desarrollo de la etapa adulta, muestra defectos en tejidos como la vulva o gónada. Estos tejidos son los únicos que continúan desarrollándose en el individuo adulto y requieren de una alta coordinación de la división celular, además de una alta tasa de división. Más concretamente, al estudiar el extremo distal de la línea germinal de C. elegans, donde los núcleos se dividen mitóticamente, hemos observado que la ausencia de un complejo THO funcional genera inestabilidad genética en mitosis y activa el checkpoint de replicación en dichos núcleos. Estos datos concuerdan con los resultados anteriormente publicados en levaduras (Gómez-Gónzalez et al., 2009). La esterilidad de los mutantes THO en C.elegans, hizo que pensaramos en un posible papel de THO en el mantenimiento de la estabilidad genética durante meiosis. A través de la meiosis se generan los gametos o células sexuales, por lo que su correcto funcionamiento es vital para el mantenimiento del genoma a lo largo de generaciones. En la gónada del nematodo existe un punto de transición donde se produce la inducción de la meiosis. En los mutantes thoc-2, la meiosis no se llega a finalizar, lo cual explica el fenotipo de esterilidad. Para el correcto transcurso de la meiosis es necesario la producción de roturas de doble cadena del ADN (DSBs), dependientes de la endonucleasa SPO-11, necesarios para la formación de los quiasmas meióticos. En los mutantes thoc-2, hemos observado un incremento de DSBs independientes de SPO-11. Estos DSBs no llegan a ser reparados, dando como resultado un incremento de 4-5 veces de los niveles de cuerpos apoptóticos debido a la activación del control de ciclo celular. Para ver si estos fenotipos estaban conservados en otros organismos, extendimos nuestros análisis a la levadura S. cerevisiae, con los mutantes hpr1¿ de THO. Igualmente, se observaron marcadores de daño en el ADN, que dieron lugar a la activación del checkpoint mediado por Rad53, proteína que controla la respuesta a daños externos durante meiosis, que derivaba a un descenso en la viabilidad de las esporas. Específicamente se observó que la pre-replicación meiótica era defectuosa en ambos organismos, existiendo retrasos en el transcurso de dicha fase y afectando al resto del ciclo meiótico. Uno de los intermediarios descritos como responsables de la inestabilidad genética asociada a transcripción de los mutantes THO es la estructura denominada R-loop. Los R-loops se forman co-transcripcionalmente justo detrás del paso de la RNPII, entre el ARN mensajero naciente y la hebra molde de ADN, desplazando la hebra no molde de ADN como cadena sencilla (Aguilera y García-Muse, 2012). La mutación de cualquier subunidad del complejo THO impide que la ribonucleopartícula se ensamble correctamente, quedando el ARN mensajero naciente desnudo, lo cual permite que pueda aparear con la hebra de ADN transcrita y forme estructuras en R-loops. Varios estudios han demostrado el impacto que la formación de estructuras R-loops tienen en la inestabilidad genética durante mitosis (Huertas and Aguilera, 2003; Li and Manley, 2005). A través de la microinyección o sobreexpresión, en nematodos y levaduras respectivamente, de la enzima ARNasa H, que degrada específicamente el ARN de los híbridos ADN:ARN, observamos que la presencia de R-loops es parcialmente responsable de los defectos en la replicación meiótica, ya que se suprimieron parcialmente el retraso de la pre-replicación meiótica y activación del checkpoint celular en los mutantes THO. Durante la transcripción, la estructura de la cromatina supone un obstáculo para la RNPII. Existen modificaciones post-traduccionales de las histonas, constituyentes de los nucleosomas, que están asociadas con una transcripción activa, facilitando el paso de la RNPII. En mutantes del complejo THO, hemos visto que estas modificaciones no se encuentran alteradas. Por el contrario, existen modificaciones asociadas a genes o regiones inactivas, denominadas heterocromatina que dificultan la transcripción. Entre ellas, se encuentra la H3K9me2 o H3S10P. Las mutaciones de THO aumentan los niveles de cromatina inactiva y de condensación cromosómica. Especialmente llamativo fue el aumento de la fosforilación del residuo H3S10 durante mitosis y meiosis en levaduras, C. elegans o humanos. Esta fosforilación tambien tiene un papel en transcripción en interfase y sinergístico con las distintas acetilaciones que facilitan la transcripción. Su implicación en la condensación de la cromatina está relacionada con la segregación de los cromosomas (Hsu et al., 2000; Wei et al., 1999). Para estudiar si este fenómeno tiene algún efecto en la inestabilidad genética descrita para THO, hemos usado dos mutantes de la histona H3 donde la Serina10 ha sido sustituida por aspártico (H3S10D), mimético con el estado fosforilado de la serina y la sustitución por alanina (H3S10A), que no puede ser fosforilada, así como los dobles mutantes con hpr1¿. Dicha fosfrilación tiene un papel en el mantenimiento de la estabilidad genética, ya que la desregulación de la fosforilación de H3S10 genera inestabilidad genética, de manera independiente a su estado de fosforilación, al igual que es esencial en el mantenimiento de la estabilidad genética en un fondo mutante THO, suprimiéndose los fenotipos de hiper-recombinación de ambos mutantes H3S10 hpr1¿ respecto al mutante simple hpr1¿, así como la activación del checkpoint celular. Al analizar la distribución de la señal H3S10P a lo largo del genoma, se observó que ésta se encuentra asociada principalmente a centrómeros, regiones pericentroméricas y regiones transcritas. Además, el incremento de los niveles de H3S10P está ligado a la acumulación de R-loops en dichas zonas, ya que el mutante separador de función hpr1-101, que posee los defectos en elongación de la transcripción celular de hpr1¿ pero que no llega a formar estructuras R-loops, muestra un perfil silvestre de la fosforilación. Acorde con el papel en la condensación de la cromatina descrito para H3S10P, los mutantes THO muestran un incremento de los niveles de condensación del ADN. Por tanto, nuestro trabajo sugiere por primera vez un papel activo de los R-loops en la estructura de la cromatina que dan lugar a una condensación de la misma y una heterocromatinización, contribuyendo al silenciamiento transcripcional y a los defectos en la progresión de las horquillas de replicación como fuente de fragilidad cromosómica e inestabilidad genética previamente descritos. Referencias Aguilera A, García-Muse T. 2012 R loops: from transcription by products to threats to genome stability. Mol Cell. Apr 27; 46(2):115-24. Aguilera, A. and Gomez-Gonzalez, B. 2008. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat Rev Genet 9(3): 204-217. Gomez-Gonzalez, B., Felipe-Abrio, I., and Aguilera, A. 2009. The S-phase checkpoint is required to respond to R-loops accumulated in THO mutants. Mol Cell Biol 29(19): 5203-5213. Hsu JY, Sun ZW, Li X, Reuben M, Tatchell K, Bishop DK, Grushcow JM, et al. 2000. Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipl1/aurora kinase and Glc7/PP1 phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell 102(3): 279¿291. Huertas, P. and Aguilera, A. 2003. Cotranscriptionally formed DNA:RNA hybrids mediate transcription elongation impairment and transcription-associated recombination. Mol Cell 12(3): 711-721. Li X and Manley JL. 2005. Inactivation of the SR protein splicing factor ASF/SF2 results in genomic instability. Cell 122(3): 365¿378. Strässer K, Masuda S, Mason P, Pfannstiel J, Oppizzi M, Rodriguez-Navarro S, Rondón AG, Aguilera A, Struhl K, Reed R, Hurt E. 2002. TREX is a conserved complex coupling transcription with messenger RNA export. Nature. May 16; 417(6886):304-8. Wei Y, Yu L, Bowen J, Gorovsky M.A, Allis C.D (1999) Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97(1):99¿109