Análisis proteico diferencial del colículo inferior en el modelo de epilepsia experimental GASH/Sal tesis doctoral

Résumé

El hámster GASH/Sal (Genetic audiogenic seizure, Salamanca) es un modelo experimental de epilepsia audiógena de origen genético, cuyo foco epileptogénico es el colículo inferior (CI). Las crisis son provocadas por sonidos intensos con una latencia de unos pocos segundos, por lo que deben existir diferencias proteicas en el CI que expliquen el desencadenamiento de los procesos ictales en condiciones basales. En esta tesis doctoral, se estudian las diferencias proteicas en el CI del GASH/Sal en relación a los animales silvestres (controles), utilizando diversas metodologías de estudio de proteínas. Como objetivos específicos se proponen: 1) Identificar las proteínas diferencialmente expresadas en el CI de GASH/Sal en relación con los controles; 2) Realizar un análisis ontológico (GO) de los genes que codifican dichas proteínas y determinar las rutas metabólicas en las que están implicados; 3) Realizar un análisis de interacción entre las proteínas analizadas; 3) Confirmar por análisis de expresión génica (RT-qPCR) las proteínas más significativas, y 4) Buscar la relación con procesos epileptógenos. Para llevar a cabo el diseño experimental, se ha empleado una amplia batería de técnicas, entre las que se encuentran técnicas de valoración proteica, de biología molecular y técnicas bioinformáticas. Se han utilizado 54 hámsteres dorado control y 62 animales GASH/Sal, de 3 a 4 meses de edad, machos y en ausencia de estimulación sonora para el desencadenamiento de crisis audiogénicas. Tras extraer las proteínas del CI, se procesaron para su digestión enzimática y se realizaron análisis comparativos del contenido proteico mediante distintas técnicas. Los espectros proteicos se identificaron en bases de datos específicas, localizado su ubicación subcelular y se seleccionaron las proteínas diferencialmente expresadas (PDEs). Posteriormente, se realizaron análisis ontológicos y estudios de interacción génica y proteica para determinar la importancia de esas proteínas en el desarrollo del fenotipo epiléptico. Finalmente, se confirman mediante técnicas de RT-qPCR las proteínas más significativas. Se analizaron y compararon los resultados de los siguientes métodos de detección y cuantificación de proteínas; iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta), SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico + espectrometría de masas) y SHOTGUN. El mayor número de PDEs se consiguió empleando SHOT GUN, seguido por SDS-PAGE y por ITRAQ. Tanto para las proteínas sobreexpresadas como infraexpresadas se observa una gran coincidencia entre SDS-PAGE y SHOT GUN, aunque esta última técnica arroje un número mayor de PDEs en comparación con el método SDS-PAGE. Por otra parte, la coincidencia entre cualquiera de estos dos métodos y el método ITRAQ resultó muy baja. Entre las proteínas PDEs que aparecen sobreexpresadas destacan las proteínas que forman parte del complejo I (NADH deshidrogenasa) de la cadena respiratoria mitocondrial implicado en la transferencia de electrones en la síntesis de ATP. Entre las enfermedades asociadas a uno de los genes codificantes de estas proteínas, gen FARSA, se encuentra la deficiencia combinada de la fosforilación oxidativa tipo 4, un desorden caracterizado por presentar distrés mitocondrial. Entre las proteínas detectadas por SDS-PAGE y SHOT GUN, destaca la proteína relacionada con la endocitosis postsináptica (ATAD1), asociada también a la aparición de movimientos involuntarios. Entre las PDEs infraexpresadas, algunas están implicadas en el metabolismo de glucógeno o la glicolisis. Otras están relacionadas con transporte y la secreción de sustancias, entre las que destacan proteínas relacionadas con el movimiento mediado por vesículas desde, hacia y dentro del aparato de Golgi, así como las proteínas relacionadas con la secreción de insulina. Finalmente, se detectaron proteínas relacionadas con el comportamiento. Las conclusiones de esta tesis doctoral indican que existen diferencias proteicas de base en el CI del modelo GASH/Sal en relación con los animales controles. El CI del modelo GASH/Sal sobreexpresa proteínas que participan en el control de la neurotransmisión y la hiperactivación neuronal frente al estímulo, lo que pudiera explicar la susceptibilidad GASH/Sal a desencadenar crisis convulsivas. Muchas de las proteínas diferencialmente expresadas están relacionadas con el metabolismo de los hidratos de carbono y el metabolismo energético. El transporte activo a través de la membrana axonal es imprescindible para mantener la homeostasis iónica en el interior de la célula, por lo que cambios en los niveles de proteínas que sintetizan ATP pueden alterar esa homeostasis. Varias proteínas del citoesqueleto aparecen sobreexpresadas en condiciones basales en el núcleo epileptógeno del modelo GASH/Sal. Estos cambios pueden alterar la red de microtúbulos y el transporte de vesículas y receptores que necesitan ser anclados o transportados a la membrana, especialmente ante un proceso de hiperexcitabilidad, como el que sucede en las crisis audiógenas del GASH/Sal.