Regulation of gene expression program by the MAPK Sty1 and the transcription factor Atf1

Résumé

INTRODUCTION Especies reactivas de oxígeno (ROS) son una variedad de moléculas derivadas de oxígeno molecular durante diferentes procesos metabólicos. ROS puede reaccionar con diferentes componentes celulares resultantes de la peroxidación lipídica, la oxidación de proteínas y el daño del ADN. Organismos unicelulares tienen que hacer frente a una amplia gama de cambios ambientales y la exposición a compuestos tóxicos. Ellos han desarrollado sistemas elaborados para detectar variaciones con respecto a intensidad, concentraciones o presencia de tales variables para adaptarse mediante la aplicación de la respuesta correcta, con el fin de proliferar y sobrevivir. La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe es un excelente modelo para estudiar la respuesta al estrés y otros procesos celulares tales como ciclo celular o empalme a nivel molecular. Esta sola célula eucariota no es patógeno y fácil de cultivar y manipulado en el laboratorio. Importante para el estudio del estrés oxidativo y otros procesos y vías celulares es la capacidad de este organismo para crecer en un estado haploides. Como consecuencia, los genes no esenciales se pueden eliminar fácilmente mediante técnicas clásicas de recombinación de ADN. En respuesta a peróxido de hidrógeno (H2O2), S. pombe activa diferentes vías de señalización en función de la gravedad de la tensión ejercida, median por lo menos por dos factores de transcripción (TFS), la AP-1 como Pap1 y la bZIP Atf1 controlados por el mitógeno activado por la proteína quinasa. En la levadura de fisión, las vías Pap1 y Sty1 constituyen las respuestas protectoras clave al estrés oxidativo. Pap1 inducir adaptación mientras Sty1 promueve respuestas de supervivencia. Sty1 parece ser necesario para la activación Pap1 a altas dosis de oxidante debido al papel de peroxiredoxin Tpx1, en la activación dependiente de H2O2 Pap1 [1, 2]. En S. pombe, la MAPK Sty1 se activa tras varias situaciones de estrés, como el estrés osmótico y oxidativo, la radiación UV, choque térmico o fase estacionaria. Desde la modulación de la expresión génica es uno de los principales resultados de esta respuesta, nos hemos centrado este trabajo sobre la caracterización de la vía Sty1 como sensor de estrés oxidativo y los diferentes eventos moleculares que conducen a la activación transcripcional programa. Hemos también, sin embargo, estudiado el papel de la traducción por alargador en la inducción de la respuesta al estrés [3]. RESULTADOS 1. Función de los componentes de la vía Sty1 en las respuestas de H2O2 Muchos quinasas de señalización modulan la expresión génica a través de fosforilaciones reguladoras de sus sustratos diana o TFS u otras proteínas ADN-vinculados. En S. pombe, la MAPK Sty1, a través de la TF Atf1, se requiere para muchos de los inducidos por el estrés transcripcional cambios que suceden en el estrés. Mientras tanto, varios artículos sigue siendo poco clara; todavía era desconocido si la actividad quinasa de la proteína es esencial para una respuesta de estrés adecuada o si la localización de Sty1 fue el único aspecto necesario para activar la transcripción. Varios informes indican que: (i) H2O2 necesita la presencia de los componentes de explotación MAK2 y mak3 [4]; (ii) algunos residuos de cisteína en Sty1 son importantes para el estrés H2O2 [5, 6]; y (iii) la proteína que interacciona con MCS4 TDH1 (gliceraldehído-3P-deshidrogenasa) recibe la entrada de H2O2 y la transmite a la vía [7]. Por otra parte, no se había determinado si la actividad quinasa de la proteína es esencial para una respuesta de estrés adecuada o si la localización nuclear de Sty1 fue el único aspecto necesario para activar la transcripción. En una attemp para evaluar el papel de Wis4 y Win1 en la respuesta a diversas formas de estrés, la activación de Sty1 se monitorizó bajo osmostress o el estrés oxidativo. La activación Sty1 fue totalmente derogada tras deleton de MAPKKK, ¿wis4 ¿win1. En consecuencia, las células que carecen de uno de los MAPKKK tienen deffects crecimiento en placas con el H2O2, y el doble mutante crece aún peor que mutatns individuales. Hemos analizado que la activación constitutiva de la respuesta de estrés en células pyp1 ¿es Wis1- y Sty1-dependiente. También hemos encontrado que el triple mutante ¿wis4 ¿win1 ¿pyp1 muestra recuperación de la actividad Sty1 como a la misma extender como ¿células pyp1. ¿Cuál puede ser la quinasa que fosforila Wis1 y por lo tanto Sty1 en esta triple ¿wis4 ¿win1 ¿pyp1 mutante? Es poco probable que cualquier quinasa diferente de Wis1 podría fosforilada Sty1, ya que ¿wis1 ¿pyp1 células no muestran Sty1 fosforilación [8]. Sin embargo, puede haber formas de fosforilados Wis1 distinto Wis4-Win1. Hemos encontrado que la supresión de tor1, que codifica una quinasa implicada en la señalización de hambre de nutrientes, fue capaz de suprimir la hiper-activación de Sty1 de triple de la mutante ¿wis4 ¿win1 ¿pyp1. Eso sugiere una estrecha relación entre el estrés y las vías de hambre de nitrógeno. 2. Regulación de la expresión génica programa estrés por la MAPK Sty1 y la TF Atf1 La MAPK Sty1 regula las respuestas transcripcional que promueven la supervivencia celular provocada por diferentes tensiones ambientales en S. pombe. Tras la activación estrés, Sty1 migra al núcleo, donde estimula un programa de expresión génica a través de la TF Atf1. Atf1 contiene una cremallera de leucina básica (bZIP) DNA-dominio. Se ha creído durante mucho tiempo que Atf1 fosforilación por Sty1 es esencial para su activación. Sin embargo, el grupo de Nic Jones informó que un mutante que carece Atf1 los 11 sitios de fosforilación de MAPK tiene una actividad similar a una proteína de tipo salvaje. También muestran que el mutante nonphosphorylatable es muy inestable, y señalan que la principal función de la fosforilación Sty1 dependiente es estabilizar Atf1 más que para activarla [9]. Queda todavía no está claro el papel de Sty1 y Atf1 en la regulación de la transcripción. Por otra parte, los sitios de fosforilación de Atf1 cruciales para su función son todavía desconocidos. Nos hemos centrado nuestro trabajo en la caracterización de la función principal de Sty1 y Atf1 en la regulación de la expresión de genes de CESR. Para ello, se han generado diferentes plásmidos que expresan diferentes mutantes fosforilación de Atf1 que imitan la forma hiper-fosforilada o hipo-fosforilada. Hemos encontrado que las células que expresan un mutante Atf1.10M, con 10 SP-TP mutado a A o I, sensibles a H2O2. Por otro lado, las células que expresan un mutante Atf1.10D imitando una hiper-phosphorylatable son más restitant al peróxido que las células de tipo salvaje. Para investigar más a fondo el papel de Atf1 y Sty1 en la activación transcripcional, decidimos reemplazar el sitio CRE de promotores GPD1 y CTT1 por un sitio de unión Gal4. Se verificaron primero que las células que expresan la versión mutada de estos dos promotores no presentan la inducción del gen. Entonces construyó dos plásmidos que permiten la expresión de la Gal4 HA-etiquetados solo o Gal4 fusionado a Atf1. A continuación, expresó ambas proteínas en las células con el sitio CRE ubicado en promotores GPD1 y CTT1 sustituye por el sitio de unión de Gal4. Como era de esperar, la transcripción se recupera sólo cuando G4-Atf1 se expresó y no con el G4 solo. Sin embargo, ambas proteínas unidas a la cromatina [10]. 3. Respuestas celulares antioxidantes: Un enfoque genético para estudiar carroñeros H2O2 de S. pombe: diferentes roles o peroxirredoxinas y catalasa. Anteriormente en el laboratorio, la Tpx1, peroxiredoxin se caracterizó como el principal captador de H2O2 en condiciones aeróbicas, porque las células eliminadas en Tpx1, no son capaces de crecer en placas en condiciones aerobias. Se encontró que la deleción del gen que codifica para la tiorredoxina reductasa, trr1, es un supresor de la sensibilidad al crecimiento aeróbico de ¿TPX1. Mostramos supresión de trr1 suprime el fenotipo anaeróbica, porque las células tienen entonces la activación constitutiva de Pap1, lo que desencadena la expresión de hasta 80 genes, incluyendo catalasa (aumento de 17 veces). Por lo tanto, se muestra que la sobreexpresión de CTT1 es suficiente para permitir el crecimiento de ¿TPX1 bajo una atmósfera aeróbica. Por otra parte, también muestran que la sobreexpresión de CTT1 es suficiente para rescatar la sensibilidad a los peróxidos de ¿ATF1 o ¿Pap1 células, a pesar de que estos dos TFS son capaces de desencadenar muchos genes diferentes en respuesta a los peróxidos. Estos resultados fueron publicados este año en Microbiología Molecular [11]. objetivos El principal objetivo de mi trabajo de tesis fue entender mejor la respuesta transcripcional regulada por la sola MAPK Sty1 sobre imposición estrés en S. pombe. Los objetivos específicos fueron: (i) la caracterización de los componentes de la vía MAPK Sty1 sobre el estrés oxidativo; (ii) la regulación de la expresión génica programa por la MAPK Sty1 y la TF Atf1; (iii) el estudio que los carroñeros están involucrados en la respuesta al estrés antioxidante, tanto bajo condiciones basales y estresado. Bibliography 1. 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