Effect of the constant photoperiod and melatonin on the ram seminal characteristics of breeds reared in equatorial areas

Resum

La estacionalidad reproductiva de la especie ovina, ligada al fotoperiodo, es considerada como un factor limitante de la producción ovina en países cuya latitud determina la existencia de estaciones astronómicas bien diferenciadas. En estas zonas, los cambios en el fotoperiodo, a través de variaciones en la secreción de melatonina nocturna, regulan la actividad de la reproducción ovina tanto en hembras como en machos. En el caso del morueco, a pesar de que la producción de semen es continua a lo largo del año, se aprecian cambios significativos tanto en los componentes del plasma seminal, como en los parámetros de calidad y funcionalidad espermática entre la época reproductiva y la no reproductiva. Durante los últimos años, nuestro grupo de investigación ha estudiado el efecto de la melatonina sobre la reproducción del morueco en condiciones de fotoperiodo variable o estacional. Estos trabajos han evidenciado variaciones en la concentración de melatonina en el plasma seminal de esta especie entre las distintas estaciones. Además, se ha demostrado la síntesis de melatonina extrapineal en el testículo, al igual que la presencia de receptores de melatonina (MT1 y MT2) tanto en este órgano como en la membrana plasmática de los espermatozoides, lo que sugiere que la melatonina estaría relacionada con la calidad seminal del morueco. El hecho de que la incubación de los espermatozoides ovinos con melatonina disminuya los marcadores apoptóticos y niveles de ROS apoya esta hipótesis. Además, esta hormona es capaz de modular la capacitación espermática en función de su concentración, posiblemente a través de su unión al receptor MT2 en la membrana del espermatozoide. Sin embargo, los ovinos se encuentran ampliamente distribuidos a nivel mundial, y algunas razas se hallan ubicadas en latitudes donde el fotoperiodo es constante, es decir, la variación de la luz a lo largo del año es mínima o casi nula. En esta tesis se planteó como hipótesis que, aunque la melatonina no regulé la estacionalidad reproductiva en los moruecos de la zona ecuatorial, esta hormona ejerce una función importante en la reproducción de estos animales. Por ello, el objetivo de la presente tesis fue evaluar el efecto del fotoperiodo constante y de la melatonina en las características seminales de moruecos ubicados en la zona ecuatorial. Colombia es un país situado en la zona ecuatorial, donde el fotoperiodo es constante (12L:12D), con solo 32 minutos de diferencia entre el día más largo y el más corto del año. Sin embargo, los factores climáticos, como las precipitaciones, sí que pueden variar a lo largo del año, presentando un patrón bimodal de lluvias, alternadas con dos periodos de sequía. Este y otros factores podrían, de algún modo, modular la actividad reproductiva de los ovinos y otras especies ganaderas de esta zona. En Colombia, dependiendo de la altura sobre el nivel del mar, se crían ovinos de lana o de pelo. Tres de las principales razas ovinas de lana que se distribuyen en las zonas de altura son la raza Criolla de lana, autóctona y derivada de cruces indiscriminados de razas introducidas por los colonizadores desde el siglo XVI, y dos razas ovinas especializadas, Romney Marsh y Hampshire, de origen británico, que fueron introducidas en el país en el último siglo. Para comprobar si en condiciones ecuatoriales de fotoperiodo constante existían variaciones en la concentración de melatonina en plasma seminal a lo largo del año, tal y como se había observado en moruecos situados en latitudes medias con fotoperiodo variable, el primer objetivo de esta tesis fue evaluar la concentración de melatonina en el plasma seminal de los moruecos ubicados en la zona ecuatorial a lo largo del año. El estudio se llevó a cabo en las tres razas anteriormente nombradas (Criolla de lana, Romney Marsh y Hampshire), y se analizaron también los niveles de testosterona y la actividad de las enzimas antioxidantes, ya que en razas de latitudes medias se había observado una correlación con los niveles de melatonina. Los resultados (Artículo 1) demostraron que, a pesar de estar en condiciones de fotoperiodo constante, la concentración de melatonina en el plasma seminal de estos moruecos varía a lo largo del año en todos los animales estudiados, independientemente de su raza. El plasma seminal obtenido durante las épocas de sequía presentó mayores niveles de melatonina que el obtenido en las épocas de lluvia. Debido a que la distribución de las lluvias afecta la disponibilidad y la calidad del alimento, es probable que los cambios en la concentración de melatonina en el plasma seminal se deban a cambios en la disponibilidad y concentración de fitomelatonina en el forraje, lo que explicaría la falta de diferencia entre razas (Artículo 1). Además, a diferencia de lo observado en moruecos de latitudes medias, en condiciones de fotoperiodo ecuatorial la concentración de melatonina no correlaciona con la de testosterona o la actividad de las enzimas antioxidantes. En relación a la concentración de testosterona sólo se observó variación anual en las razas introducidas (Romney Marsh y Hampshire), pero el incremento de testosterona ocurrió antes que el incremento en los niveles de melatonina, por lo que su variación no reflejaría una activación del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal por la melatonina. Con objeto de dilucidar si el régimen fotoperiódico puede afectar a la composición del plasma seminal (objetivo 2), se llevó a cabo un estudio comparativo de los componentes de este fluido entre moruecos ubicados en latitud ecuatorial (Colombia; razas Criolla de lana y Romney Marsh) y en una zona de latitud media (España; raza Rasa Aragonesa), durante el mismo periodo de tiempo (artículo 2). El plasma seminal fue obtenido entre septiembre y noviembre, que coincide con el inicio de la época reproductiva en los moruecos de Rasa Aragonesa, y con la segunda época de lluvias en los moruecos de la zona ecuatorial. La concentración de melatonina y de testosterona detectada en plasma seminal de los moruecos ubicados en la zona ecuatorial fue menor que la de moruecos de latitudes medias. También se encontraron diferencias en la concentración de enzimas antioxidantes, pero no en la concentración total de proteína ni en la composición proteica. Dadas las diferencias en la concentración de melatonina en plasma seminal entre moruecos ubicados en zonas de fotoperiodo constante y zonas de fotoperiodo variable y, puesto que la melatonina puede tener un origen pineal o testicular, nos planteamos como tercer objetivo determinar el origen de la melatonina del plasma seminal de moruecos ubicados tanto en latitudes medias como en la zona ecuatorial. Para ello, se analizó el plasma seminal de moruecos enteros y vasectomizados de las razas Criolla de la lana y Romney Marsh (ubicadas en Colombia), y de la raza Rasa Aragonesa (ubicada en España), y se determinó, además de la concentración de melatonina, la de testosterona, la actividad de enzimas antioxidantes y la cantidad de proteínas (artículo 2). Los resultados mostraron que la concentración de melatonina era significativamente menor en moruecos vasectomizados, pero solo en aquellos situados en latitudes medias. Esto sugiere que, en machos enteros en estas latitudes, la melatonina del plasma seminal tiene un doble origen, testicular y pineal. Sin embargo, en moruecos de la zona ecuatorial no se observaron diferencias en la concentración de melatonina en plasma seminal entre machos enteros y vasectomizados, lo que podría sugerir que, o bien no hay síntesis de melatonina testicular, o bien esta no es secretada al plasma seminal. Por otro lado, la concentración de testosterona disminuyó tras la vasectomía en animales ubicados en ambas latitudes. También disminuyó la concentración de proteínas, sobre todo a nivel de las proteínas de alto peso molecular, que tendrían origen en el epidídimo y testículos. Finalmente, la actividad de las enzimas antioxidantes no se vio afectada por la vasectomía, lo que corrobora su origen en las glándulas accesorias. Una vez identificada la presencia de melatonina en el plasma seminal de moruecos de la zona ecuatorial, y dado que esta hormona ejerce gran parte de sus funciones a través de sus receptores de membrana, el cuarto objetivo de esta tesis fue identificar la presencia y la distribución de los receptores de melatonina MT1 y MT2, en la membrana de espermatozoides de moruecos de la zona ecuatorial y evaluar su posible variación entre las épocas de lluvia y de sequía (artículo 3). Los resultados evidenciaron la presencia de ambos receptores en los espermatozoides de las tres razas (Criolla de lana, Romney Marsh y Hampshire), identificándose los mismos inmunotipos descritos para MT1 en machos de latitudes medias, además de dos nuevos inmunotipos para el receptor MT2. Se observaron diferencias en los porcentajes de inmunotipos, tanto para el receptor MT1 como para el MT2, con respecto a lo descrito previamente en moruecos de latitud media. También se observaron diferencias entre razas y entre épocas para la distribución de ambos receptores, a diferencia de lo que sucede en fotoperiodo variable, en los cuales sólo se habían observado diferencias estacionales para el receptor MT2. Sin embargo, en cuanto a la densidad de receptores evidenciada por estudios densitométricos, únicamente la raza Criolla de lana presentó diferencias entre épocas en la cantidad del receptor MT1, lo que sugiere que, salvo esta excepción, las diferencias en la distribución de este receptor no estarían acompañadas de cambios en la cantidad del mismo. Además, la raza Criolla de lana también presentó una densidad del receptor MT2 significativamente menor que las razas introducidas, independientemente de la época climática, y que podría estar relacionada con su mayor adaptación al fotoperiodo ecuatorial. Los resultados también mostraron la tendencia de MT2 a formar homodímeros o heterodímeros con otros receptores de la familia GPCR, pero no con MT1, a diferencia de lo observado en moruecos de latitudes medias, donde se evidenciaron heterodímeros de MT1 y MT2. Una vez detectada la presencia de melatonina en el plasma seminal y de los receptores para la misma en la membrana espermática, nos planteamos como quinto y último objetivo evaluar si la melatonina podía regular la capacitación espermática en estas razas, al igual que lo hace en razas localizadas en zona de fotoperiodo variable. Previamente a la consecución de este objetivo, se hizo necesario estudiar los requisitos y la respuesta a la capacitación in vitro de las razas Criolla de lana, Romney Marsh y Hampshire ubicadas en latitudes ecuatoriales, ya que no se había estudiado hasta el momento. Este estudio se llevó a cabo tanto en época de lluvias como de sequía (artículo 4). Nuestros resultados demostraron que la adición al medio de capacitación de sustancias que elevan el AMPc intracelular (medio cocktail) es capaz de incrementar de forma significativa el porcentaje de espermatozoides capacitados de moruecos de la zona ecuatorial, al igual que sucede en los de latitudes medias, aunque se observaron diferencias entre razas y épocas. La melatonina, tanto a concentración 100 pM como 1 µM evitó parcialmente el incremento de espermatozoides capacitados después de la incubación en las tres razas estudiadas, a diferencia de los descrito en moruecos de latitudes medias, donde sólo la concentración alta previno la capacitación. En las tres razas de la zona ecuatorial se observaron diferencias entre épocas para el efecto de la melatonina, siendo mayor en general en la época lluviosa, pero en cualquier caso este efecto de la melatonina fue menos aparente en la raza Criolla de lana. Esto podría estar relacionado con la menor densidad del receptor MT2, que fue observada en el artículo 3 de esta tesis. La adición de melatonina en el medio de capacitación también tuvo un efecto positivo sobre el porcentaje de espermatozoides vivos sin inversión de fosfatidilserina, que también fue más evidente en la estación de lluvias. Se ha descrito previamente que el receptor MT1 es el encargado de mediar el efecto antiapoptotico de la melatonina, al igual que el MT2 se ha relacionado en la especie ovina con su efecto modulador de la capacitación. Es probable que la mayor concentración de melatonina en el plasma seminal en época de sequía, como se ha demostrado en el artículo 1, de lugar a una menor respuesta de los espermatozoides a la adición exógena de la misma, por la desensibilización de los receptores tras la exposición previa a la alta concentración melatonina presente en este fluido. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral evidencian variaciones en la concentración de melatonina en plasma seminal de moruecos situados en latitudes de fotoperiodo constante, además de la presencia de receptores de melatonina MT1 y MT2 en sus espermatozoides. Estos resultados, junto con los obtenidos tras capacitar in vitro los espermatozoides en presencia de melatonina, sugieren que, en estos animales, la melatonina ejercería otras funciones distintas a la regulación de la estacionalidad, como la modulación de la capacitación espermática o un efecto antiapoptótico, lo que abre nuevas líneas de investigación sobre el uso de melatonina para la mejora de la fertilidad en razas ovinas en latitudes ecuatoriales.