Funcionalización enzimática de la celulosa bacteriana para su aprovechamiento y valorización

Resum

Recientemente, el interés en la celulosa se ha desplazado hacia materiales de la nanoescala que incluyen las nanofibrillas de celulosa (NFC), los nanocristales de celulosa (NCC) y la celulosa bacteriana (CB). La CB es un exopolisacárido sintetizado por algunas bacterias. Su composición química es la misma que la de la celulosa vegetal, pero su conformación y sus propiedades fisicoquímicas son diferentes. La CB presenta un mayor grado de pureza, tiene índices de cristalinidad más elevados y mayor capacidad de retención de agua. Además, presenta una gran elasticidad, buena resistencia mecánica y es biocompatible. Todas estas propiedades le confieren una gran aplicabilidad en campos muy diversos. La CB se produce en forma de una red tridimensional de nanofibras que genera una estructura con una elevada área superficial con potencial para la adhesión y retención de moléculas. El objetivo de esta tesis, la funcionalización de la CB dentro de un marco de tecnologías amigables con el medio ambiente, se ha abordado desde dos vertientes: la inmovilización de enzimas y la generación de NCC, todo ello reflejado en un compendio de cinco artículos. Previamente al estudio de la idoneidad de diferentes matrices de CB como soporte para la inmovilización de enzimas lipasas, se procedió a la mejora genética de la lipasa LipJ de Bacillus cereus JR3. Esta cepa exhibía una actividad lipasa hipertermófila en su sobrenadante, una característica de gran interés de cara a una aplicación industrial. Sin embargo, LipJ, a pesar de su similitud de secuencia con otras lipasas termófilas bacterianas, no era la responsable de esta actividad. La meta del primer estudio fue, pues, revertir este comportamiento mesófilo a termófilo a través de una mutagénesis dirigida en los dominios de su centro catalítico y en el péptido señal y a través de la creación de una librería de degeneración NNK en la posición H110, implicada en la activación dependiente de la temperatura de lipasas termófilas. Las diferentes variantes obtenidas con ambas estrategias mostraron un cambio de tendencia en la especificidad de sustrato, pero sin rasgos de termofília. Estas circunstancias, unidas a la baja actividad de la lipasa original, condujo a su descarte como enzima a inmovilizar sobre la CB. La dificultad en discriminar entre la actividad debida a LipJ o a la actividad intrínseca de la cepa hospedadora, Escherichia coli, inspiró el objetivo del segundo estudio de la tesis. Esta actividad basal, aunque conocida por la comunidad científica, apenas se encuentra documentada, y es la causa de interferencias en la caracterización de lipasas. Por estas razones, se procedió a la caracterización de esta actividad en las cepas más comunes de E.coli empleadas en la clonación y expresión heteróloga de lipasas. Como se describe en el tercer artículo, se empleó una lipasa comercial para estandarizar el proceso de inmovilización por adsorción física sobre dos matrices de CB: CB en suspensión acuosa (BCS, por sus siglas en inglés Bacterial Cellulose Suspension) y papel de CB (BCP por sus siglas en inglés Bacterial Cellulose Paper). Los nanocomposites de Lipasa/CB obtenidos presentaron excelentes propiedades operacionales. Los nanocomposites Lipasa/BCP mostraron una gran estabilidad térmica, reusabilidad y durabilidad, además de mantenerse activos después de ser almacenados durante más de un mes a temperatura ambiente, por lo que podrían ser potenciales candidatos en la elaboración de papeles bioactivos de dispositivos simples, portátiles y desechables. Siguiendo la misma metodología, en la siguiente investigación se generó un papel de CB funcional con actividad antimicrobiana y antioxidante, mediante la inmovilización de la lisozima. A temperatura ambiente, la enzima inmovilizada mostró una mayor estabilidad que la lisozima libre, aparte de conservar la totalidad de su actividad durante casi tres meses. Debido a la naturaleza intrínseca de sus componentes, el papel Lisozima/BCP es biodegradable y biocompatible, lo que lo convierte en candidato ideal para el diseño de nuevos materiales de envasado en la industria alimentaria. Finalmente, en el último artículo se describe la producción de NCC de CB (NCCB), a partir de un proceso más sencillo y respetuoso con el medioambiente que la tradicional hidrólisis ácida con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico. Mediante un tratamiento con monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMOs), responsables de aportar cargas negativas y proporcionar una mayor estabilidad, y una digestión con glucosil hidrolasas, se obtuvieron unos NCCB de entre 80 nm y 2 µm de longitud y 9 nm de ancho. Sus propiedades permitieron su uso como agentes de recubrimiento sobre soportes celulósicos de origen vegetal, aportándoles propiedades barrera al agua y al aceite, además de mejorar sus cualidades mecánicas.