Tecnología LAMPdiagnóstico en diferentes escenarios epidemiológicos

Zusammenfassung

La aparición de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos hace unas décadas permitió perfeccionar la detección de agentes infecciosos y supuso una revolución en el diagnóstico microbiológico. Con la introducción de la PCR y sus distintas variantes surgió definitivamente el concepto de diagnóstico molecular, que ha permitido la detección rápida y sensible de microorganismos mediante la amplificación específica de determinadas regiones de su genoma. Actualmente, su uso ha pasado a ser rutinario para el diagnóstico de las enfermedades más habituales en los laboratorios de referencia, pero no así para un gran número de enfermedades importadas y, mucho menos, para aquellas enfermedades tropicales que ocurren en zonas endémicas de escasos recursos. La elección de la técnica diagnóstica dependerá de las características del laboratorio y el objetivo que persigamos en el diagnóstico. De este modo, un caso importado será generalmente estudiado en un laboratorio de referencia bien equipado y con personal especializado. Sin embargo, la detección de un caso en zona endémica, generalmente en zonas inaccesibles durante estudios de campo, requerirá de una prueba tradicional microscópica o una técnica rápida. En cualquier caso, a una técnica diagnóstica se le debe de exigir la máxima especificidad y sensibilidad, reproducibilidad, facilidad de ejecución y un bajo coste. Las técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos son las que más se acercan a cumplir estos requisitos. Entre ellas, la tecnología de amplificación mediada por bucle (LAMP, del inglés Loop-mediated isothermal amplification) es actualmente la más utilizada y sobre la que más se ha trabajado para conseguir acercar el diagnóstico molecular realizado en un laboratorio de referencia a estudios de campo y diagnóstico point-of-care. De esta manera, la tecnología LAMP podría utilizarse en diferentes contextos epidemiológicos. Teniendo en cuenta lo anterior, nos planteamos como objetivo general de este trabajo la evaluación de la tecnología LAMP como método diagnóstico en diferentes situaciones epidemiológicas. Para ello, definimos una serie de objetivos específicos encaminados a la aplicación y desarrollo de esta tecnología para abordar nuevos estudios epidemiológicos, ante situaciones de emergencia sanitaria, o como diagnóstico point-of-care en áreas endémicas con escasos recursos. Estos objetivos se van presentando y alcanzando en los diferentes artículos de investigación que se presentan en esta Tesis Doctoral. El primer objetivo específico tuvo como finalidad evaluar en el laboratorio la técnica LAMP para la detección de Loa loa en muestras de sangre obtenidas en un estudio de campo realizado en Guinea Ecuatorial. Se llevó a cabo el examen microscópico para la búsqueda de microfilarias y parte de esas muestras se almacenaron en papel de filtro (Dried Blood Spots; DBS). Se obtuvo el ADN de los DBS utilizando un método de extracción simple y se analizaron mediante técnicas moleculares, incluyendo una PCR anidada y Loa loa-LAMP colorimétrico y a tiempo real. Los resultados obtenidos se compararon con la microscopía como método diagnóstico de referencia. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, se notificaron en España, mayoritariamente en la comunidad de Castilla y León, siete casos de Fiebre Hemorrágica de Crimea-Congo (FHCC) transmitidos por picadura de garrapata. Ante este nuevo escenario, nos planteamos como segundo objetivo específico el desarrollo de un ensayo RT-LAMP (Reverse transcription-LAMP) para la detección de diferentes genotipos del virus de Crimea-Congo y su evaluación en muestras de plasma y, por primera vez, de orina de pacientes con diagnóstico confirmado por RT-qPCR de referencia. El tercer objetivo específico propuesto tuvo como finalidad aplicar un método LAMP diseñado para la detección de Plasmodium spp. en el diagnóstico point-of-care de malaria en Cubal, Angola. Evaluamos y comparamos los resultados obtenidos mediante las técnicas de microscopía, pruebas de diagnóstico rápido (PDR) y LAMP en el diagnóstico de la malaria. Posteriormente, analizamos la reproducibilidad del método LAMP colorimétrico y a tiempo real en un laboratorio de referencia. En conclusión, los resultados más relevantes de los distintos trabajos de investigación que se presentan muestran que: i) el método Loa loa-LAMP presenta un rendimiento diagnóstico mayor que la microscopía y que la técnica de PCR; ii) este método presenta mayor sensibilidad que la técnica de PCR en el análisis de muestras de sangre almacenadas como DBS; iii) el método RT-LAMP desarrollado para la detección del virus de Crimea-Congo permite el diagnóstico de la infección en muestras clínicas con resultados equiparables a la RT-qPCR de referencia, detectando distintos genotipos circulantes del virus; iv) el método LAMP colorimétrico para la detección de Plasmodium spp. presenta mayor sensibilidad que la microscopía y las PDR en condiciones de campo.