Desregulación génica en el núcleo epileptógeno de un modelo preclínico de epilepsiaimplicaciones del polimorfismo de nucleótido único p.His289tyr en el gen de la subunidad 1 del receptor de kainato

Resumen

La epilepsia, un trastorno neurológico caracterizado por la predisposición sostenida a la generación de crisis convulsivas, engloba diversas manifestaciones comportamentales derivadas de la actividad neuronal aberrante en el cerebro. Comprender los complejos mecanismos subyacentes a estas crisis convulsivas es esencial para avanzar en la investigación y tratamiento de esta enfermedad neurológica. En las últimas décadas, la investigación en epilepsia se ha beneficiado notablemente de modelos animales diseñados para replicar los síntomas clave de la enfermedad. Estos modelos ofrecen una plataforma esencial para comprender aspectos genéticos y moleculares, contribuyendo significativamente al avance en el conocimiento y tratamiento de la epilepsia. El modelo animal empleado en esta tesis doctoral, conocido como como hámster con convulsiones audiogénicas de origen genético (GASH/Sal, del inglés Genetic audiogenic seizures hamster from Salamanca), se distingue por experimentar crisis convulsivas generalizadas de tipo tónico-clónico en respuesta a estímulos sonoros intensos, manifestando similitudes notables con las crisis de tipo Gran Mal observadas en humanos. Esta tesis doctoral tiene por objetivo ampliar la comprensión de los mecanismos genéticos y moleculares subyacentes a las convulsiones audiogénicas en el modelo GASH/Sal, proporcionando una plataforma valiosa para la investigación preclínica en epilepsia. Para ello, la tesis abarca diseños experimentales que involucran técnicas muy diversas como análisis in silico y modelaje de estructuras proteicas, técnicas moleculares para el análisis de expresión génica y de proteínas, así como inmunohistoquímica para la visualización de proteínas mediante microscopía de campo claro y microscopía láser confocal, junto con técnicas electrofisiológicas. La tesis doctoral se presenta por compendio de tres artículos científicos publicados en revistas indexadas en el Journal Citation Reports. El primer artículo tuvo como objetivo identificar las alteraciones en el patrón de expresión de genes en el colículo inferior (CI), el foco epileptogénico, del hámster GASH/Sal después del estado epiléptico. Empleando la técnica de secuenciación de ARN (RNA-Seq) se realizó un estudio comparativo entre el transcriptoma del CI de animales GASH/Sal frente al de animales control, hámsteres sirios dorados (Mesocricetus auratus), ambos sometidos a una estimulación sonora intensa, obteniendo un total de 36 genes diferencialmente expresados: 24 sobreexpresados (Egr1-4, factores de transcripción -Fosb, JuncB, Fos y Npas4-, genes involucrados en canales de potasio Kcns1 y Kcnj13-, transportador de nucleósido Slc28a1-, Gass45g y Ttr, entre otros) y 12 infraexpresados (como dos genes relacionados con las rutas de señalización de calcio -ATp2a3, Grin2c- y la proteína del complemento C6). Este resultado fue posteriormente validado mediante la técnica de retrotranscripción combinada con la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Los genes diferencialmente expresados se clasificaron en categorías ontológicas asociadas con eventos epileptógenos similares a los producidos por las convulsiones tónicas generalizadas en humanos. Los análisis no solo revelaron cambios en la expresión génica asociados a las convulsiones audiogénicas sino también en la expresión de genes involucrados en rutas metabólicas, destacando las vías de señalización de interleucinas-4 y -13, así como las vías de transporte de nucleósidos y bases nitrogenadas en la membrana plasmática. En la vía glutamatérgica, identificamos varios genes diferencialmente expresados que correspondían con genes mutados previamente descritos, destacándose la mutación de un polimorfismo de nucleótido único en el gen Grik1 (del inglés, glutamate receptor ionotropic kainate-1) que codifica la subunidad del receptor glutamato ionotrópico, de kainato tipo 1 (GluK1). Dicha mutación consiste en la sustitución de una citosina (C) por una timina (T) en la posición 9586732 de este gen Grik1, que implica el reemplazo en su proteína codificante del aminoácido histidina (His, H) en la posición 289 por una tirosina (Tyr, Y) (p.His289Tyr). El segundo artículo tuvo por objetivo explorar el impacto de esa mutación en la estructura y conformación de la proteína GluK1, así como en el patrón de expresión génica de Grik1 y de su proteína GluK1 en las áreas cerebrales asociadas a las crisis convulsivas del modelo GASH/Sal. La predicción de la estructura tridimensional de GluK1 mostró una alteración en la conformación de la proteína en el dominio amino-terminal y una predicción correspondiente a un aumento en la estabilidad de la proteína. El análisis mediante RT-qPCR detectó alteraciones en el perfil de transcripción del gen Grik1 dentro de la red neuronal asociada a las convulsiones audiogénicas. Adicionalmente, los resultados de Western blot mostraron modificaciones en los niveles de expresión de la proteína GluK1 en varias estructuras cerebrales, acompañadas por una distintiva isoforma de menor peso molecular en los colículos inferior y superior. Esto se correlaciona con disparidades en la distribución de la inmunoreactividad para GluK1 en múltiples regiones cerebrales, incluyendo el cerebelo, hipocampo, subdivisiones de los colículos inferior y superior, y la corteza prefrontal. Destacó la inmunoreactividad difusa que se acumulaba en el soma neuronal, fibras axonales y terminales nerviosos, exhibiendo una concentración prominente en proximidad al núcleo celular. Esto sugiere posibles alteraciones en el mecanismo de transporte de GluK1, que podría afectar posteriormente la transmisión sináptica de glutamato. Finalmente, el tercer artículo evaluó el impacto funcional de también la mutación p.His289Tyr, teniendo en cuenta su posible efecto en el dominio amino-terminal que está implicado en el ensamblaje del canal receptor y el tráfico citoplasmático a la membrana. Examinamos, mediante la técnica de fijación de voltaje de dos electrodos, las corrientes evocadas por el kainato (IKas) en receptores GluK1 de tipo silvestre (control) y mutados expresados heterólogamente en ovocitos de Xenopus laevis, identificando una mejora en el porcentaje de IKas en Gluk1_p.His289Tyr en comparación con el control, sin que se manifestarán afectadas sus propiedades funcionales. De acuerdo con estos resultados, también observamos que GluK1_p.His289Tyr presenta un mayor direccionamiento hacia la membrana plasmática en ovocitos de X. laevis y una mayor incorporación de la proteína en la membrana. Estos resultados corroboran los obtenidos en el segundo artículo, sugiriendo posibles trastornos en el mecanismo de transporte de GluK1, con impacto en la transmisión sináptica de glutamato. En conjunto, esta tesis doctoral respalda la relevancia del modelo GASH/Sal en la investigación de las crisis convulsivas, facilitando la identificación y caracterización de genes, sustratos moleculares y aspectos morfológicos asociados a este fenómeno. Estos hallazgos respaldan no solo futuras investigaciones en el campo de la epilepsia, sino que también sientan las bases para el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas al sistema glutamatérgico en general y, de manera más específica, a los receptores de tipo kainato.