Characterization and improvement of a self-assembled spindle in fission yeast meiosis

Resumen

Los centrosomas son los principales centros organizadores de microtúbulos en las células eucariotas. En mitosis y meiosismasculina, los centrosomas nuclean y organizan los microtúbulos que construyen el huso, el aparato macromolecularque genera y guía las fuerzas físicas necesarias para segregar los cromosomas en las células hijas. Por el contrario, en lameiosis femenina de la mayoría de metazoos, la célula progenitora femenina activamente elimina los centrosomas anteso durante las divisiones meióticas. Consecuentemente, el huso meiótico se ensambla y segrega cromosomas en ausenciade la guía de los centrosomas (`huso acentrosómico). La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe es excelente paraestudiar la meiosis, aunque esta mantiene los SPBs (equivalentes fúngicos de los centrosomas) en meiosis y, entonces, elhuso meiótico sigue siendo mediado por los SPBs en este organismo (huso dependiente de SPB). Esta diferencia con lameiosis femenina de metazoos limita el potencial de esta levadura para estudiar la base molecular subyacente al husoacentrosómico, interesante para entender los errores meioóticos que afectan a la fertilidad y salud humanas. En nuestro laboratorio, hemos generado un sistema de levadura de fisión (bqt1 sad1.2) en el que los SPBs están aisladosde la envoltura nuclear, de tal forma que la formación huso dependiente de SPBs está abolida. Aquí, observamos unarray de microtúbulos con una morfología y dinámicas típicas de un huso y capacidad de segregación de cromosomasa pesar del aislamiento de los SPBs, hipotetizando que esta estructura es un huso autoensamblado, independiente delos SPBs en la meiosis de la levadura de fisión, análogo al huso acentrosómico independiente de los centrosomas en lameiosis femenina de metazoos. En esta tesis doctoral, exploramos la posibilidad de dicho tipo de huso, optimizandolas condiciones experimentales para su formación y estudio. Confirmamos la formación del huso autoensamblado independientementede los SPBs y validamos esto reproduciéndola mediante genotipos alternativos. También, describimosque su ensamblaje depende del polimerizador y nucleador de microtúbulos Alp14/XMAP215 y que el entrecruzador demicrotúbulos Ase1/PRC1 es necesario para mantener su integridad estructural durante su elongación. Sin embargo, suformación es mayormente independiente de la actividad del complejo de -tubulina y, en su lugar, depende de mecanismosconservados en metazoos, cruciales para la formación del huso acentrosómico, como la ruta del quinetocoro yel gradiente de RanGTP. Más allá, mejoramos su robustez estructural y fidelidad de segregación de cromosomas conla eliminación de la Quinesina-8, específicamente Klp6 pero no Klp5. Por último, estandarizamos nuestra metodologíapara la obtención, observación por videomicroscopía de fluorescencia y análisis del huso autoensamblado, lo cual permitióuna caracterización más en detalle de su ensamblaje, dinámica de elongación y segregación de cromosomas.