Desarrollo de sistemas inteligentes para tratamientos contra el cáncer colorrectal

Zusammenfassung

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los diferentes tipos de enfermedades que engloba el concepto de cáncer, ocupando el tercer lugar en incidencia a nivel mundial y es el segundo en mortalidad. La detección temprana es crucial para la supervivencia, y el tratamiento varía desde la cirugía en etapas tempranas hasta opciones más complejas en etapas avanzadas. A pesar de los avances, la investigación es esencial para reducir los efectos secundarios de los tratamientos y optimizar su selectividad, mejorando así la calidad de vida de los pacientes. La baja biodisponibilidad y falta de especificidad de los medicamentos antineoplásicos convencionales han llevado al interés creciente en el uso de nanomedicina en quimioterapia. Por ello, se han desarrollado sistemas de administración de fármacos que mejoran la biodistribución, actividad terapéutica y selectividad de los tratamientos. El objetivo central de esta tesis ha sido mejorar la eficacia de las terapias existentes y reducir los efectos secundarios, aprovechando las diferencias metabólicas entre células normales y cancerígenas. Con este fin, se llevaron a cabo tres estrategias. La primera estrategia desarrollada se enfocó en inhibir la proliferación celular al actuar simultáneamente sobre dos rutas metabólicas de las células cancerígenas. Para lo cual se utilizaron dos compuestos: pregnenolona (P5) y farnesol (FOH). P5 impide que las células tengan la energía necesaria para proliferar al inhibir la acción de la enzima G6PD en la ruta pentosa fosfato (PPP), mientras que, FOH impide la formación de membranas en las nuevas células inhibiendo la síntesis de fosfatidilcolina. Sin embargo, como ocurre con muchos de los fármacos anticancerígenos, estos compuestos tienen carácter hidrofóbico. Por lo que, se propuso el uso de ciclodextrinas (CD), oligosacáridos de alta solubilidad y estructura cónica hidrófoba, capaces de formar complejos de inclusión con moléculas huésped y mejorar las propiedades fisicoquímicas y farmacológicas de dichos compuestos. En primer lugar, se caracterizó la formación de los complejos de inclusión formados entre las moléculas de FOH y P5 con una ciclodextrina, SBE-CD. Las razones para usar esta CD es que tiene una elevada solubilidad acuosa y la ventaja de estar aprobada por la FDA. Los resultados de caracterización revelaron que la temperatura afectaba significativamente el proceso de complejación y que era instantáneo, obteniendo complejos con una estabilidad mínima de 2 meses. A continuación, se evaluó la toxicidad in vitro de P5 y FOH, tanto en su forma libre como en complejo (SBE-CD P5 y SBE-CD FOH), determinándose en cada caso, la concentración necesaria para inhibir un 50 % la proliferación celular (IC50). Dicho estudio evidenció que, en el caso de SBE-CD, las concentraciones superiores a 1 mM eran desfavorables para la viabilidad celular, señalando la necesidad de trabajar con niveles inferiores, para que la ciclodextrina no afecte a la proliferación celular. Respecto a la pregnenolona (P5), se presentaron ciertos problemas, como la necesidad de concentraciones elevadas de SBE-CD P5 para alcanzar la IC50 o la precipitación de P5 cuando se utilizaba en su forma libre. Por estas razones se descartó la pregnenolona como posible tratamiento anticancerígeno y se suspendió su investigación. Por el contrario, los resultados obtenidos con el farnesol, tanto en su forma libre como en el complejo con SBE-CD, mostraron una IC50 prometedora, destacando mayor selectividad en la viabilidad de las líneas cancerígenas de colon, hígado y mama, en comparación con los fibroblastos normales. Los análisis del ciclo celular revelaron que el mecanismo de acción de FOH consistía en inhibir la síntesis de fosfatidilcolina (PC), este hecho se corroboró con ensayos de viabilidad celular. A su vez, la visualización microscópica destacó cambios morfológicos, como pérdida de adherencia y reducción celular, confirmando la eficacia del tratamiento. La investigación de esta estrategia finalizó con la validación in vitro de la eficacia terapéutica de SBE-CD FOH, mediante ensayos con cocultivos. Los resultados demostraron su capacidad para reducir significativamente la viabilidad en líneas cancerígenas de colon e hígado, preservando la viabilidad en células normales. Además, se exploró la posibilidad de reducir costos al verificar que la toxicidad de farnesol no dependía significativamente del tipo de isómero utilizado. En conjunto, los resultados sugieren que los complejos de inclusión con FOH tienen un potencial terapéutico significativo en líneas cancerígenas. Sin embargo, con el propósito de dirigir de forma más específica los fármacos hacia las células cancerígenas, se llevó a cabo una segunda estrategia basada en encapsular los compuestos en exosomas. En primer lugar, se aislaron los exosomas utilizando diferentes métodos y se caracterizaron. Inicialmente se utilizó el producto comercial ExoQuick-TC ULTRA para aislar exosomas, pero las muestras presentaban interferencias en la cuantificación y determinación de proteínas, lo que llevó a descartar este método. En contraste, el método de ultracentrifugación resultó efectivo, permitiendo el aislamiento de exosomas cuya forma esferoide se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Además, el análisis de Dispersión Dinámica de Luz (DLS) reveló que tenían diámetros inferiores a 200 nm. Y el ensayo de Western Blot (WB) confirmó la presencia de proteínas CD9 y HSP-70 confirmando que se trataba de exosomas. Posteriormente, los exosomas fueron cargados con los compuestos hidrófobos utilizando diversas técnicas. No obstante, debido al descarte de P5, se decidió trabajar con un compuesto ampliamente estudiado, Paclitaxel (PTX). La cuantificación de fármacos reveló que la extrusión era el método más eficaz, ya que se alcanzaban concentraciones de FOH y PTX más altas. Con estos exosomas se realizó una evaluación de la toxicidad in vitro y los resultados indicaron que los exosomas sin carga no afectaban significativamente a la viabilidad celular después de 48 horas, mientras que la viabilidad se redujo con los exosomas cargados con FOH y PTX. Los exosomas procedentes de la línea cancerígena cargados con FOH redujeron en mayor medida la viabilidad celular que los procedentes de la línea normal. Además, se produjo el mismo efecto con los cargados con PTX, aunque en este caso la reducción de la viabilidad fue mucho mayor. Al comparar estos resultados con los de SBE-CD FOH, se observó que los exosomas redujeron la viabilidad de las células cancerosas de manera similar, pero afectando en menor medida a las células normales. Por lo que los exosomas, se presentan como una estrategia prometedora para el transporte selectivo en el tratamiento del cáncer colorrectal. Los resultados obtenidos sugieren que los exosomas pueden ofrecer ventajas significativas en términos de selectividad y eficacia en comparación con otras formas de administración de fármacos. Para finalizar esta tesis, se buscó mejorar el tratamiento local de CCR, llevándose a cabo una tercera estrategia que implica el desarrollo de una terapia local con hidrogeles termosensibles cargados con FOH. En una primera etapa, se determinó la composición óptima de hidrogeles compuestos por Pluronic F-127 (PF-127) y Goma Gellan (GG), a través de pruebas reológicas y evaluación de la degradación del gel. Se concluyó que la concentración óptima de PF-127 para obtener geles termosensibles estables era del 20 w/v. Esta concentración permitió trabajar con soluciones líquidas a temperaturas inferiores a la ambiente y garantizó la formación de geles estables una vez alcanzada la temperatura de gelificación. La adición de GG al gel favoreció la formación de interacciones poliméricas, resultando en un aumento del módulo de almacenamiento, la viscosidad y la velocidad de degradación. GG demostró ser eficaz para controlar la sensibilidad a la temperatura, y una concentración del 0.50 w/v duplicó la velocidad de degradación sin afectar significativamente la temperatura de gelificación. Posteriormente, se estudió el impacto de añadir FOH, tanto como fármaco libre o en forma de complejo de inclusión, en la reología y degradación del gel, utilizando geles con un 20 de FP-127 y 0.5 de GG. La principal conclusión fue que concentraciones elevadas de FOH libre afectaban negativamente la reología del gel debido a la formación de una emulsión. Por otro lado, la presencia de ciclodextrina (CD) producía una disminución del módulo de almacenamiento y la viscosidad, pero una prolongación del tiempo de degradación, esto se debe a que las cadenas hidrófobas de PF-127 formaban un complejo con la CD. Finalmente, se llevó a cabo un estudio de la cinética de liberación de FOH, permitiendo prever los parámetros que controlan la transferencia de materia tanto en el interior como en el exterior del hidrogel. Los estudios de liberación del fármaco indicaron que era sostenida y proporcional a la degradación del gel. Sin embargo, aunque la liberación de FOH libre resultó en concentraciones superiores a su solubilidad, se recomendaba el uso del complejo para lograr una solubilidad total del fármaco liberado con el fin de que pueda internalizar en las células. Estos resultados respaldan la posibilidad de emplear dicho hidrogeles como sistemas de liberación controlada para el tratamiento oncológico localizado. Además, se destaca el potencial de estos hidrogeles para ser utilizados en la simulación de tumores como se detalla en el Anexo I. Los resultados obtenidos de las tres estrategias presentaron avances significativos en la mejora del tratamiento del CCR. La estrategia de utilizar farnesol en forma de complejo con la ciclodextrina demostró eficacia terapéutica, los exosomas cargados con FOH y PTX exhibieron prometedores niveles de selectividad y los hidrogeles termosensibles ofrecen una terapia local controlada con liberación sostenida de FOH. Estos enfoques, basados en la nanotecnología y la terapia local, abren nuevas perspectivas para optimizar los tratamientos actuales contra el CCR. Todos estos estudios establecen una sólida base para futuras investigaciones, como el desarrollo de hidrogeles que permitan la liberación de exosomas cargados con farnesol y Paclitaxel, de tal forma que actúen únicamente contra células cancerígenas. Además, se podrían perfeccionar los hidrogeles, con el fin de que tengan una doble acción: liberación local de fármacos y regeneración del tejido dañado.