Nuevos marcadores de funcionalidad espermática aplicados en la evaluación de los protocolos de conservación seminal en el carnero

Resumen

El empleo de nuevos marcadores de calidad seminal, así como su aplicación práctica, son una pieza clave para la optimización de los protocolos de conservación de semen (refrigeración y congelación), y en consecuencia para la difusión de la inseminación artificial en la especie ovina. Sin embargo, los parámetros de calidad seminal empleados en la actualidad tienen una escasa correlación con la fertilidad. Por tanto, la caracterización de nuevos marcadores permitirá la detección del daño espermático durante estos procesos haciendo posible el diseño de estrategias para reducir sus efectos. En la presente Tesis Doctoral, se realizaron un total de cinco propuestas experimentales que se plasmaron en cinco artículos científicos. Durante los procesos de conservación seminal, el balance redox juega un papel fundamental en el control del daño celular. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) tienen un papel dual en el espermatozoide contribuyendo por una parte al mantenimiento de la homeostasis (maduración y capacitación espermática), y por otra, induciendo daños cuando la sobreproducción sobrepasa la capacidad celular de detoxificarlos. Hasta ahora, la evaluación espermática se ha basado en la detección de ROS sin dar importancia a su función específica o su localización exacta en el espermatozoide. En el primer trabajo, se caracterizaron dos sondas señalizadoras de ROS (CellROX™ Deep Red (CRDR) y CellROX™ Green (CRG)) evaluando su expresión mediante citometría de flujo y su localización mediante microscopía de fluorescencia. Se seleccionaron muestras con diferente calidad seminal inicial: recogidas dentro (BS) y fuera de la estación reproductiva (NBS), criopreservadas (Cryo) y tratadas con peróxido de hidrógeno (Control positivo) como control de daño oxidativo. El marcaje de CRDR se expresó de forma mayoritaria en las muestras frescas de BS, es decir, aquellas con mejores resultados de viabilidad y motilidad. Por el contrario, el marcaje de CRG fue mayor en las muestras seminales con peor calidad (Cryo y Control positivo) coincidiendo con un incremento de la peroxidación lipídica, apoptosis y fragmentación del ADN. Además, ambas sondas presentaron una localización diferente en el espermatozoide: CRDR se localizó en la pieza intermedia (región donde asienta la masa mitocondrial) y mientras que el CRG lo hizo en el núcleo. Estos resultados nos permiten hipotetizar que CRDR podría estar asociado con la funcionalidad mitocondrial mientras que CRG con daño en el espermatozoide. Debido a la importancia del balance redox en los protocolos de conservación seminal, en el segundo y tercer trabajo, se implementaron nuevas estrategias de medida en muestras descongeladas. Para ello, además de otros análisis de calidad seminal empleados previamente como la motilidad o la apoptosis, se utilizó una técnica novedosa para medir el balance redox basada en la medida del potencial oxido-reducción (RedoxSYS®) de forma integrada. Para la validación del RedoxSYS®, en el segundo trabajo, se congelaron muestras seminales previamente suplementadas con diferentes antioxidantes y se analizó tanto la calidad seminal post-descongelación como los resultados de la fertilidad. El sistema RedoxSYS® resultó ser la técnica con mayor capacidad discriminante en la elección del mejor tratamiento antioxidante (Trolox 1 mM). La adicción de Trolox mejoró la viabilidad espermática y el equilibrio redox así como la fertilidad y la frecuencia de partos múltiples. Por lo tanto, el uso del RedoxSYS® podría ser una herramienta clave en la evaluación espermática de los protocolos de conservación seminal. En el tercer trabajo se analizaron las actividades enzimáticas de la superóxido dismutasa (SOD) y de la glutatión peroxidasa (GPX) como marcadores específicos relacionados con el balance redox. En este caso, se estudió la congelabilidad de los espermatozoides utilizando como modelo práctico la frecuencia de recogida seminal. Los machos fueron sometidos a tres frecuencias de recogida seminal consecutivas, de duración mensual: 0 recogidas semanales (0CW), 4 (4CW) y 10 (10CW). El grupo de alta frecuencia de recogida (10W) mostró una disminución de la calidad seminal postdescongelación y de la actividad antioxidante de las enzimas SOD y GPX. Estos resultados podrían sugerir que los espermatozoides no completarían su maduración y verían limitada su capacidad de generar suficientes enzimas antioxidantes para controlar la producción de ROS. Por tanto, podemos concluir que la SOD y la GPX podrían actuar como biomarcadores de congelabilidad proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes al daño espermático desencadenado por la criopreservación. En los últimos años, se han caracterizado nuevas biomoléculas relacionadas con la funcionalidad espermática y el éxito tras la fecundación como las proteínas ProAKAP4 (localizada en la vaina fibrosa del espermatozoide) y Transmembrana 95 (Tmem95) (localizada en la membrana plasmática) en diferentes especies de mamíferos, aunque su empleo no ha sido validado en la especie ovina. En el cuarto estudio, se caracterizó la expresión y la concentración de ProAKAP4 en muestras seminales tras la refrigeración y la criopreservación con el fin de determinar su correlación con la calidad seminal. Se observó que la concentración de la proteína postdescongelación disminuyó al igual que el resto de parámetros de calidad seminal analizados, como era esperable. Sin embargo, a diferencia del resto de parámetros de calidad espermática, la concentración de la proteína sufrió un descenso durante la refrigeración (15ºC 6 horas) lo que podría estar relacionado con las variables tasas de fertilidad descritas en esta especie. Finalmente, en el quinto estudio se caracterizó la expresión de la proteína Tmem95 que tiene un papel fundamental en la unión ovocito-espermatozoide, y por lo tanto, en la capacidad fecundante. Para ello se valoró su expresión por citometría de flujo en diferentes estados funcionales del espermatozoide: tras someter a los espermatozoides a un proceso de capacitación, refrigeración y congelación. Por una parte, se observó una mayor expresión de esta proteína tras el proceso de capacitación in vitro. Por otro lado, la Tmem95 disminuyó en su expresión tras el proceso de congelación y de refrigeración (48h 5ºC), mostrándose en este último caso como un indicador más sensible cuando se comparó con otros parámetros de calidad seminal (motilidad total y apoptosis). De este modo, podría considerarse un marcador temprano de daño espermático derivado del shock por frío que produciría la desestabilización de la membrana y afectaría negativamente a su capacidad fecundante. Los resultados recogidos en esta Tesis Doctoral revelan que los nuevos marcadores y técnicas de análisis de calidad seminal empleados, son cruciales para la monitorización y optimización de los protocolos de conservación seminal (refrigeración y congelación) en el carnero.