Métodos y medios para monitorizar la alteración de la homeostasis tisular en el cuerpo total

Resumo

Un método para determinar el estado de salud de un sujeto, para la detección temprana de daño tisular, para el diagnóstico precoz y el control de una enfermedad, y/o para la evaluación de la eficacia del tratamiento en un sujeto usando macrófagos de tejido en circulación como espejo homeostasis interrumpida y enfermedad en un tejido, comprendiendo el método las etapas de:

a) tinción de una muestra de ensayo biológica aislada del sujeto, cuya muestra se sabe o se espera que contenga macrófagos de tejido en circulación (CTM) con un panel de anticuerpos distintos diferenciadamente marcados contra los marcadores de armazón CD14, CD16 y CD300e y preferiblemente además HLADR, para la identificación y enumeración de diferentes subconjuntos de MC;

b) fijación, permeabilización y tinción de la CTM usando uno o más anticuerpos de detección dirigidos contra uno o más epítopos sobre al menos un fragmento proteico inducido por proteasa derivado de la degradación intracelular de una proteína no CTM por CTM individual en sus tejidos de origen, identificando de este modo al menos un subconjunto de macrófagos circulantes específicos de tejidos (CTSM);

c) análisis por citometría de flujo multiparamétrico de dichos CTM y CTSM teñidos por regulación para los marcadores de la armazón CD14, CD16 y CD300e para determinar la cantidad de señales de cada anticuerpo marcado distinto asociado con células individuales, en donde el análisis comprende realizar una estrategia de regulación basada en la expresión de la superficie celular de CD300e, CD14 y CD16, en combinación con análisis de dispersión lateral (SSC), y en la que la estrategia de regulación está compuesta de (i) una etapa de inclusión para incluir monocitos clásicos y CTM basados en la expresión de CD300e en combinación con el análisis por dispersión lateral (SSC), y (ii) una etapa subsiguiente de identificación de subconjuntos para discriminar los monocitos clásicos CD14alto/CD16 de CTM e identificar subconjuntos dentro de la población CTM;

d) determinar el número relativo y absoluto de células individuales dentro de cada subconjunto CTM y cada subconjunto específico de CTSM que expresan cada uno de los epítopos intracelulares medidos;

e) calcular (i) el número relativo y absoluto de células dentro de cada subconjunto CTM y cada subconjunto específico de CTSM, cada uno de los cuales proviene de diferentes tejidos normales y alterados como se define por un conjunto de fragmentos individuales de proteína inducida por proteasa evaluados, y ii) la cantidad de la señal relacionada con anticuerpos asociada a cada péptido intracelular individual evaluada para obtener un perfil de tinción CTSM de ensayo; y

f) comparar el perfil de tinción CTSM de ensayo con un perfil de tinción CTSM normal para cada tejido evaluado, en el que un perfil de tinción de ensayo aberrante es indicativo de daño tisular, alteración de la homeostasis del tejido, presencia de una enfermedad y/o efectividad del tratamiento frente a resistencia.