Caracterización y estudio de compuestos bioactivos, propiedades antioxidantes y mecanismos de acción antibacteriana de diferentes variedades de miel española

Résumé

La miel es una sustancia natural dulce de composición compleja, producida por la abeja Apis mellifera a partir de néctar o de mielatos. Desde la antigüedad la miel ha sido utilizada no solo como alimento sino también como remedio medicinal y en las últimas décadas numerosos estudios científicos corroboran los efectos beneficiosos por los que hasido utilizada empíricamente. La presente memoria de Tesis Doctoral titulada “Caracterización y estudio de compuestos bioactivos, propiedades antioxidantes y mecanismos de acción antibacteriana de diferentes variedades de miel española”, tiene como objetivo general seleccionar variedades de miel con adecuadas propiedades bioactivas, demostradas in vitro, para su potencial contribución terapéutica en el tratamiento de la mucositis oral. Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron quince muestras de miel de diferentes orígenes botánicos y geográficos con distintivos de calidad. Once muestras pertenecieron a las marcas de calidad diferenciada DOP Miel de La Alcarria, DOP Miel de Granada e IGP Miel de Galicia. Las cuatro muestras restantes correspondieron a mieles ecológicas certificadas de la provincia de León. En una primera fase se llevó a cabo la caracterización botánica y fisicoquímica de las muestras, así como un estudio de su calidad microbiológica. Todas las muestras habían sido etiquetadas como monoflorales. Sin embargo, el análisis palinológico confirmó que solo ocho de ellas alcanzaron los contenidos polínicos mínimos necesarios para poder ser catalogadas como mieles monoflorales de aguacate (Persea americana), castaño (Castanea sativa), romero (Rosmarinus officinalis), eucalipto (Eucalyptus sp.) y tomillo (Thymus sp.); el resto de muestras fueron mieles multiflorales con diferentes perfiles botánicos. A nivel fisicoquímico todas las muestras presentaron contenidos en agua, azúcares reductores, sacarosa, hidroximetilfurfural, ácidos libres, así como valores de conductividad eléctrica y de índice diastásico dentro de los límites establecidos por la Directiva del Consejo 2001/100. El resto de parámetros fisicoquímicos analizados se encontraron dentro de los valores descritos por otros autores para diferentes variedades de miel. Por último, los resultados obtenidos en el análisis microbiológico confirmaron la existencia de unas adecuadas prácticas de manipulación y extracción del producto. En ninguna de las muestras se detectaron mohos ni levaduras, Clostridium sulfitorreductores o los patógenos bacterianos Staphylococcus aureus, Salmonella sp. y Escherichia coli. Solo en algunas muestras se detectó la presencia de microorganismos aerobios mesófilos pero con bajos recuentos (inferiores a 103 ufc/g). La detección de un alto porcentaje de mieles mal etiquetadas conllevó la realización de un estudio complementario de búsqueda de nuevas alternativas que permitieran definir el origen botánico sin recurrir al análisis melisopalinológico; método que presenta grandes limitaciones para la industria de procesado de la miel. Se desarrolló un modelo estadístico predictivo de redes neuronales artificiales utilizando tres variables fisicoquímicas (acidez libre, color expresado en mmPfund y contenido de sacarosa) que, de forma preliminar, permitió clasificar las muestras de miel en monoflorales o multiflorales. Las variables fueron previamente seleccionadas mediante un algoritmo genético y las muestras utilizadas en el grupo de prueba fueron seleccionadas por el algoritmo Puchwein. Una vez caracterizadas las muestras, la segunda fase del estudio consistió en cuantificar los compuestos bioactivos mayoritarios, así como determinar los perfiles fenólicos de las muestras de miel, incluyendo además una muestra de miel de manuka, reconocida como miel de grado médico. Posteriormente se determinó in vitro la bioactividad de las muestras evaluando su capacidad antioxidante y antibacteriana. Se encontraron diferencias significativas entre las variedades estudiadas en lo referente al contenido en: compuestos fenólicos totales (entre 23,12 y 158,10 mg de ácido gálico/100 g de miel), flavonoides totales (entre 1,65 y 5,93 mg de catequina/100 g de miel) y vitamina C (entre 0,34 y 75,87 mg de ácido ascórbico/100 g de miel). Los perfiles fenólicos difirieron de forma relevante entre las distintas variedades, identificándose 49 compuestos fenólicos, incluyendo compuestos característicos de las variedades monoflorales. De todos los compuestos identificados 39 de ellos pudieron ser cuantificados con valores que oscilaron entre 1,29 y 7,26 mg/100 g de miel para las muestras de miel españolas y de 18,60 mg/100 g de miel para la muestra de miel de manuka que, sin embargo, mostró una menor diversidad de compuestos fenólicos. Los niveles de actividad antioxidante fueron también significativamente diferentes no solo entre las muestras sino también en función del método empleado (actividad de captación de radicales libres, evaluación del poder reductor e inhibición del blanqueamiento del ß-caroteno). Las muestras con mayor potencial antioxidante fueron una miel multifloral y una miel de castaño. Todas las muestras de miel mostraron actividad antibacteriana contra las cepas de referencia y contra cepas de interés clínico; si bien, las concentraciones eficaces fueron significativamente diferentes (entre 0,05 y 0,4 g/mL), siendo una muestra de aguacate, una de castaño y otra muestra multifloral las que presentaron una mayor actividad in vitro. Por último, teniendo en cuenta que una de las principales limitaciones del uso de la miel en la clínica humana en general, y en la lucha antibacteriana en particular, es el desconocimiento de los mecanismos a través de los cuales la miel ejerce su actividad, la fase final de este estudio consistió en desarrollar un protocolo de caracterización de los mecanismos de acción antibacteriana utilizando la técnica de citometría de flujo. En esta fase se evaluaron aquellas muestras que presentaron mayor potencial bioactivo (mieles de aguacate, castaño y multifloral), además de la muestra de miel de manuka. Las diferentes muestras de miel indujeron efectos bastante similares en las bacterias estudiadas (S. aureus y E. coli), que consistieron en una importante alteración metabólica como efecto fisiológico primario en S. aureus, así como un desequilibrio en el potencial de membrana y una lesión de la membrana sobre ambas bacterias. Sin embargo, la profundidad de la respuesta bacteriana a lo largo de todo el tratamiento varió entre las muestras de miel, probablemente debido a las diferencias en la composición química. Además, la miel de manuka demostró actividad sobre las bombas de flujo de una cepa de E. coli resistente a la tetraciclina.