Aproximación molecular al estudio de la resistencia de escherichia coli frente a tecnologías de conservación de los alimentos

Resumen

La industria alimentaria continúa utilizando los tratamientos térmicos para suministrar alimentos seguros y estables, a pesar de que, en ocasiones, afectan negativamente a sus propiedades organolépticas y nutritivas. Debido a estos efectos adversos, en los últimos años se está realizando un notable esfuerzo en la puesta a punto de nuevos sistemas de inactivación microbiana que puedan sustituir ventajosamente a los tratamientos térmicos. Entre esas mejoras se encuentra el desarrollo de métodos alternativos que permitan la inactivación microbiana sin aumentar significativamente la temperatura del alimento, como los pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV) y los antimicrobianos de origen natural, como los aceites esenciales y sus compuestos individuales (CIs). Si bien ya se han descrito aspectos fundamentales de la resistencia de las especies patógenas y alterantes o la influencia sobre esta de factores medioambientales, en esta Tesis Doctoral se propone la utilización de nuevas herramientas moleculares para profundizar en las bases biológicas responsables de la resistencia y los mecanismos de respuesta bacterianos frente a estas tecnologías, aspectos clave en el desarrollo de nuevos métodos de inactivación microbiana o procesos combinados más eficientes. Así, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue la puesta a punto y uso de técnicas de biología molecular para el estudio de los mecanismos de inactivación y resistencia de Escherichia coli MG1655 como microorganismo modelo, frente a tecnologías tradicionales y alternativas de conservación de alimentos. Concretamente, mediante la aplicación de nuevas técnicas moleculares, se han tratado de describir las estructuras diana y vías metabólicas afectadas por la acción de tratamientos térmicos, PEAV y CIs. Por un lado, gracias a la manipulación genética de los microorganismos, se pudo evaluar la influencia de genes responsables de la síntesis de enzimas del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), del aporte de hierro a la célula y del sistema de reparación del DNA en la resistencia microbiana frente a carvacrol, citral y (+)-limoneno. La comparación de la resistencia entre las cepas parentales y sus correspondientes mutantes permitió confirmar la implicación del ciclo del TCA y la reacción de Fenton, con hierro extracelular, en el mecanismo de producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) causante de la inactivación microbiana mediante (+)-limoneno. Sin embargo, en el caso del carvacrol y el citral, si bien la formación de ROS se veía inducida, provocando la inactivación de E. coli, esta no dependía del ciclo del TCA ni de la reacción de Fenton. Por otro lado, la cuantificación de la expresión de genes mediante microarrays de DNA permitió evaluar la respuesta transcriptómica de los microorganismos tras la exposición a tratamientos letales de carvacrol, citral, PEAV y calor. Se identificaron, tras los tratamientos con carvacrol, genes sobreexpresados que codificaban para la síntesis de bombas de expulsión multidrogas y para la de proteínas de choque por infección de fagos, relacionadas con la presencia de daños en las envolturas celulares. Tras los tratamientos con citral, los genes de la biosíntesis de purinas y pirimidinas aumentaron su expresión, mostrando el metabolismo activo presente en las células tras estos tratamientos. En cuanto a los PEAV, estos estudios pusieron de manifiesto la necesidad de energía y poder reductor en la reparación de los daños subletales en la membrana citoplasmática causados por estos tratamientos. Por último, la selección, obtención y estudio de cepas mutantes resistentes tras la aplicación de CIs permitió, además de profundizar en los efectos de estos tratamientos sobre la fisiología microbiana, confirmar por vez primera la capacidad de estos compuestos puros de generar microorganismos mutantes resistentes, advirtiendo de que su aplicación a concentraciones subletales podría provocar una menor efectividad de posteriores tratamientos de conservación de alimentos. La secuenciación masiva del genoma de estas cepas mutantes resistentes contribuyó a la identificación de mecanismos de resistencia frente a los CIs, que resultaron similares a los descritos en estudios previos con antibióticos bactericidas. El desarrollo de esta Tesis Doctoral requirió del uso conjunto de varias técnicas de microbiología, tanto tradicionales como moleculares, tras haber realizado la puesta a punto de estas últimas. Este estudio demuestra la importancia e interés de la combinación de diferentes técnicas microbiológicas para la evaluación de los mecanismos de inactivación microbiana por CIs, PEAV y calor, y para el diseño de procesos de conservación de los alimentos más efectivos.