Señales intracelulares implicadas en el efecto inhibitorio de la il-1 beta sobre la absorción intestinal de la d-galactosa

Zusammenfassung

La función primaria del tracto gastrointestinal es la absorción de agua, electrolitos y nutrientes. El epitelio intestinal funciona como una barrera dinámica, que bajo condiciones normales, regula el paso de agua y nutrientes excluyendo a su vez a patógenos potenciales. Hay evidencias de que las citoquinas derivadas de la respuesta inmune pueden mediar alteraciones metabólicas durante el curso de procesos infecciosos, inflamatorios, autoinmunes y neoplásicos, ya sea actuando de forma local o mediante la interacción con diferentes mecanismos endocrinos. La interleuquina-1 (IL-1), es una citoquina pleiotrópica producida por las células del sistema inmune y por una gran variedad de otros tipos celulares, incluyendo las células endoteliales. Es liberada durante los procesos infecciosos e inflamatorios, y posee un amplio espectro de actividades autocrinas, paracrinas y endocrinas. La IL-1 consta de tres miembros: IL-1¿, IL-1ß y el receptor antagonista de la IL-1(IL-1ra). La IL-1ß fue identificada como un pirógeno endógeno y administrada de forma exógena produce fiebre en animales de experimentación. Es bien conocido que las toxinas bacterianas pueden desencadenar síndrome séptico. El estado séptico se puede inducir de forma natural o experimental y puede ocasionar diferentes alteraciones en las funciones fisiológicas del intestino delgado afectando a su función más importante que es la absorción de nutrientes. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de la IL-1ß sobre la absorción intestinal del azúcar D-galactosa, nutriente presente en la dieta de los mamíferos. Asimismo, nos propusimos investigar los posibles mecanismos intracelulares implicados en esta acción y determinar la expresión del transportador de D-galactosa, SGLT1. Para ello, utilizamos como modelos experimentales el conejo y las células en cultivo de carcinoma de colon humano (Caco-2). Seleccionamos el yeyuno de conejo por ser la porción del intestino delgado que presenta máxima absorción. Se eligió este animal como modelo experimental dada la importancia económica que tiene la cunicultura en Aragón, lugar donde se ha realizado la presente investigación. Además, el conejo posee un aparato digestivo monocavitario, lo cual permite, teniendo en cuenta las limitaciones propias de un modelo animal, extrapolar al humano los resultados obtenidos. Con este modelo, utilizamos dos vías distintas de infección: sistémica (administración intravenosa de la citoquina) y local (adición directa de la IL-1ß al tejido intestinal). El transporte de D-galactosa a través del yeyuno, fue estudiado mediante las siguientes técnicas de experimentación in vitro: - Acumulación tisular de sustrato en tejido entero, técnica de Crane-Mandelstam. - Medida de flujos transepiteliales mediante cámaras tipo Ussing. - Preparación de vesículas membranosas intestinales de borde en cepillo. - Medida de la expresión de proteínas por Western-blotting. Por otra parte, utilizamos células Caco-2, como segundo modelo experimental. Esto, nos permitió estudiar el transporte intestinal de D-galactosa sin la influencia de señales nerviosas y hormonales presentes en el modelo animal. Las células Caco-2 son una línea celular de intestino que fue aislada de carcinoma de colon humano. Estas células al llegar a la confluencia forman una monocapa de células polarizadas que presentan las mismas características morfológicas y funcionales que los enterocitos maduros y además, expresan numerosos transportadores implicados en funciones absortivas y secretoras. Utilizamos células Caco-2 del clón PD7, por presentar una alta expresión de los principales transportadores involucrados en la absorción de la galactosa a nivel intestinal. Los resultados mostraron que la administración intravenosa de IL-1, indujo un estado de sépsis en los animales, con aumento de la temperatura corporal y cambios en diferentes parámetros hematológicos y hormonales. El análisis histológico por microscopía electrónica mostró que el tratamiento con la IL-1ß no alteraba la integridad de la membrana del borde en cepillo. Además, no se encontraron cambios ni el la actividad mieloperoxidasa ni en la de la fosfatasa alcalina. La capacidad funcional del intestino, se midió mediante la actividad de las principales disacaridasas del borde en cepillo (lactasa, maltasa y sacarasa) y los resultados obtenidos, no mostraron diferencias entre tejidos control o procedentes de animales tratados con la citoquina. En relación al transporte intestinal, la administración intravenosa de la citoquina inhibió el transporte Na+-dependiente de la D-galactosa del borde en cepillo sin estar afectado el gradiente electroquímico de dicho catión al no verse alterada la actividad Na+/ K+-ATPasa. La expresión de la proteína transportadora SGLT1 aumentó ligeramente aunque no de forma significativa, lo que se traduciría en una disminución de la actividad intrínseca del transportador SGLT1, con la posible implicación de las proteínas PKA, PKC, MAPKs (p38 MAPK, JNK, MEK1/2) y el proteosoma. Se estudió también, el efecto de la administración intravenosa de la IL-1ß sobre los transportadores de fármacos BCRP presentes a nivel intestinal, y los resultados mostraron una mayor expresión de dichos transportadores en el tejido procedente de animales tratados con la citoquina. Por otra parte, cuando la IL-1ß fue añadida directamente al tejido intestinal también se produjo una reducción del transporte de D-galactosa. En este caso, la citoquina no afectó a la absorción a través de las vesículas membranosas del borde en cepillo, lo que parece indicar que posiblemente la IL-1ß no tenga un efecto directo sobre el transporte y requiera de la célula intacta para ejercer su acción. Asimismo, no se modificó la actividad de la Na+/ K+-ATPasa. La expresión de la proteína transportadora SGLT1, no se modificó al igual que en el efecto sistémico. En el efecto inhibitorio de la IL-1ß sobre el transporte intestinal de D-galactosa, podrían estar implicados diferentes mediadores intracelulares entre los que se encontrarían la PKC, MAPKs (p38 MAPK, JNK, MEK1/2) y el proteosoma. Los experimentos con células Caco-2, mostraron también una disminución del transporte de D-galactosa estando implicado el factor de transcripción nuclear NF-kß. La determinación de la expresión de la proteína SGLT1 mediante Western Blotting, confirmó los resultados obtenidos en el modelo animal.