Modulación de la inmunidad innata y adaptativa por los probióticos

Resumen

Introducción Los probióticos son, por definición, microorganismos vivos, que administrados en la cantidad adecuada confieren beneficios a la salud del hospedador [1]. Debido a la gran variedad de probióticos que existen, los sistemas sobre los que actúan y los efectos que desencadenan son muy diversos. Los probióticos son capaces de modular la respuesta inmunológica, incrementándola o disminuyéndola [2]. Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígeno (CPA) que actúan como nexo de unión entre la inmunidad innata y la adaptativa [3]. Las CD actúan en tres pasos: 1) capturan y procesan los antígenos; 2) maduran y migran hacia los nódulos linfáticos mesentéricos (NLM) donde realizan la presentación antigénica a los linfocitos T; 3) actúan como adyuvantes en la activación de los linfocitos T [4, 5]. El epitelio intestinal constituye una barrera celular selectiva que permite el paso de nutrientes pero impide que los microorganismos del lumen alcancen la lámina propia, donde desencadenarían una fuerte respuesta inflamatoria. Los enterocitos, que son las principales células que constituyen el epitelio intestinal, también participan activamente en la respuesta inmunológica hacia los agentes invasores [6]. Objetivos En esta tesis nos planteamos, mediante dos objetivos principales, estudiar cómo afectarían distintas especies probióticas al sistema inmunológico (objetivo 1) y al epitelio intestinal (objetivo 2). Material y Métodos Para llevar a cabo estos objetivos se utilizaron técnicas de cultivo celular (cultivos primarios, línea celular y cocultivos) y bacteriano (6 especies probióticas y 2 patógenas en condiciones de aerobiosis o anaerobiosis), citometría de flujo (marcadores de superficie, linfoproliferación, citocinas intracitoplasmáticas), análisis de expresión génica, inmunofluorescencia (factores de transcripción y uniones estrechas), ensayos de resistencia de la monocapa epitelial y adherencia bacteriana al epitelio intestinal. Resultados Para el objetivo 1, se utilizó como modelo CD derivadas de monocitos (CDmo), que poseen características similares a las CD convencionales. Se utilizaron 4 especies de lactobacilos, 2 especies de bifidobacterias, un control patógeno Gram-positivo y un control patógeno Gram-negativo. Se estudió la capacidad de los probióticos para inducir la maduración de las CDmo analizando los cambios desde la inmunidad innata hasta la inmunidad adaptativa. El proceso de maduración conlleva una serie de cambios en las CD a nivel morfológico y funcional [7]. Los probióticos, desencadenaron distintos grado de expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) y moléculas coestimuladoras, necesarias para la presentación antigénica. Entre los probióticos utilizados destacó B. lactis que fue capaz de disminuir la expresión de estos marcadores. Mediante PCR cuantitativa (qPCR) se analizaron los cambios en la expresión de genes relacionados con la ruta de los receptores tipo Toll (TLR). Los TLR son receptores de reconocimiento de patrones (PRR) presentes en células del sistema inmunológico, como las CD, que reconocen patrones moleculares asociados a microorganismos (MAMP) [8]. La activación de estos receptores genera una respuesta innata rápida según la naturaleza del agente foráneo. El tipo de señales y de citocinas que desencadenaran estos probióticos influirá en el proceso de maduración. En general, los lactobacilos desencadenaron una mayor respuesta sobre las CDmo que las bifidobacterias. Entre los probióticos estudiados destacaron los efectos de L. fermentum y las bifidobacterias, el primero, por incrementar los niveles de ARNm de genes cuyos productos son capaces de regular la respuesta inmune como CSF3, IL10, etc. y las segundas, por disminuir la expresión de numerosos genes como CXCL10, NOD2, IFNB1, etc. El NF-kB es un factor de transcripción que ante numerosos estímulos, como bacterias, sufre una translocación al núcleo, y es el responsable de la síntesis de numerosas citocinas proinflamatorias e indispensable para la maduración de las CD [9]. A pesar de las diferencias encontradas en los análisis de expresión génica y en los marcadores de maduración, las bacterias Gram-positivas desencadenaron una activación temprana similar del NF-kB. Además, para determinar si las diferencias observadas podrían deberse a una menor capacidad de las CDmo de fagocitar determinadas especies bacterianas, se marcaron las bacterias con FITC y se cultivaron con las CDmo. Se observó que las CDmo eran capaces de fagocitar las bacterias sin problemas. Como última parte del análisis de maduración, se estudió la capacidad de proliferación y el perfil efector que inducían las CDmo estimuladas con los probióticos sobre linfocitos T vírgenes en un ensayo alogénico. El lactobacilo L. acidophilus disminuyó la capacidad proliferativa de las CDmo. De nuevo, las CDmo estimuladas con L. fermentum y B. lactis desencadenaron un aumento más moderado de la producción de IFNg por parte de los linfocitos. Para el objetivo 2, se utilizó la línea celular Caco-2 procedente de un adenocarcinoma de colon humano [10] . El epitelio intestinal participa de manera activa en la respuesta inmunológica, ya que, ante determinados estímulos, desencadena la producción de quimiocinas (IL-8, CXCL10, CCL20) que atraen al lugar de la inflamación células del sistema inmunológico, como linfocitos T efectores y neutrófilos [11, 12, 13]. La principal característica de las células Caco-2 es su capacidad de polarización y diferenciación in vitro bajo condiciones estándar de cultivo. Las células Caco-2 cultivadas durante 7 días no están polarizadas y se asemejan a los enterocitos de las criptas vellositarias. En cambio, las células Caco-2 de 21 días están completamente diferenciadas y polarizadas como los enterocitos de la punta de la vellosidad. Las células Caco-2 no polarizadas fueron más sensibles ante los estímulos, y al igual que en las CDmo, los probióticos desencadenaron diversos perfiles de expresión de las quimiocinas estudiadas. Otra de las características de las células Caco-2 es que crecen formando una monocapa celular. En el análisis de la resistencia de esta monocapa, se observó que L. salivarius incrementó de manera gradual la resistencia. Uno de los factores que interviene en la integridad de la monocapa es la estabilidad de las uniones estrechas entre las células. Entre las proteínas que forman las uniones estrechas se encuentra la Zonula Occludens 1 (ZO-1). Sin embargo, en las células Caco-2 estimuladas con L. salivarius no se observó una relación entre el incremento en la resistencia y una redistribución de ZO-1. Además de estos estudios se realizaron ensayos de adherencia para determinar la capacidad de adherencia de cada especie bacteriana al epitelio, y se observó que las bacterias probióticas fueron capaces de adherirse al epitelio en distinta medida. Los factores solubles producidos por el epitelio intestinal otorgan a las CD de la mucosa intestinal un perfil tolerogénico [14]. Las CDmo diferenciadas en cocultivo con las células Caco-2 son insensibles a la respuesta proinflamatoria de las células Caco-2, inducida por un patógeno como S. typhimurium. Sin embargo, los monocitos que se encuentran en un ambiente proinflamatorio intestinal dan lugar a CDmo con un perfil totalmente distinto al que presentan las CDmo diferenciadas en medio de cultivo basal. Conclusión general Algunos de los probióticos utilizados presentaron un efecto modulador sobre la inmunidad innnata y adaptativa actuando en diferentes rutas y distintas células. Bibliografía 1. FAO/WHO. 2002. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Ontario, Canada. 2. SHERMAN, P. M., OSSA, J. C. & JOHNSON-HENRY, K. 2009. Unraveling mechanisms of action of probiotics. Nutr Clin Pract, 24, 10-4. 3. STEINMAN, R. M. & COHN, Z. A. 1973. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. 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