Aislamiento y caracterización de variantes genéticas bacterianas resistentes como herramienta de estudio para la mejora de la conservación de alimentos

Resumen

La mejora e implementación de los métodos de conservación de los alimentos en la industria agroalimentaria precisa del conocimiento detallado de sus mecanismos de inhibición e inactivación microbiana. La aparición de cepas bacterianas resistentes en la cadena alimentaria puede comprometer la inocuidad y estabilidad de los alimentos. Sin embargo, a su vez, también pueden utilizarse como herramienta de estudio. La descripción de las bases fisiológicas responsables de la resistencia y de los mecanismos de respuesta celular permite aportar conocimiento para el diseño de estrategias de conservación más efectivas y eficientes. Por tanto, el principal objetivo de esta tesis doctoral fue la obtención de variantes genéticas bacterianas resistentes, y su caracterización fenotípica y genotípica, como estrategia para estudiar los mecanismos de resistencia celular frente al uso de antimicrobianos y otros métodos de conservación de los alimentos. Concretamente, se ha abordado por primera vez el aislamiento de variantes genéticas resistentes de Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Typhimurium y Listeria monocytogenes mediante el uso de aceites esenciales (AE) y sus constituyentes individuales (CI), con el fin de conocer las bases de sus propiedades antimicrobianas, así como profundizar en la repercusión de la aparición de estas variantes en la cadena alimentaria. En primer lugar, se realizó la puesta a punto de la metodología para la realización de ensayos de evolución, mediante la exposición prolongada a concentraciones subinhibitorias o la aplicación de tratamientos letales, logrando el aislamiento de variantes genéticas bacterianas frente a AE y CI. La determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) de las variantes aisladas y su comparación con las respectivas cepas parentales, demostraron la aparición de variantes resistentes y tolerantes frente a AE y CI tras los ensayos de evolución mediante ambos protocolos: - S. aureus frente a carvacrol, citral, óxido de limoneno y AE de naranja mediante dosis subinhibitorias. - S. Typhimurium frente a carvacrol, mediante dosis subinhibitorias y tratamientos letales, y frente a AE de tomillo mediante tratamientos letales. - L. monocytogenes frente a AE de tomillo mediante dosis subinhibitorias y tratamientos letales. No obstante, la aparición de variantes genéticas resistentes no habría sido provocada por un aumento de la frecuencia mutagénica tras la utilización de AE y CI, sino probablemente por la presión selectiva ejercida sobre las poblaciones bacterianas que permitió seleccionar aquellas variantes con mayor resistencia. La caracterización fenotípica mediante el estudio de cinéticas de crecimiento en presencia de los AE y CI y la obtención de curvas de supervivencia tras tratamientos letales, permitió explicar cómo estas variantes resistentes emergerían a lo largo de los ensayos de evolución. Por un lado, debido a una mejor adaptación y mayor velocidad de crecimiento en los ensayos a dosis subinhibitorias y, por otro lado, a causa de una mayor supervivencia bacteriana en los ensayos de tratamientos letales. Además de presentar una mayor supervivencia frente a los agentes de selección, algunas de las variantes resistentes revelaron el desarrollo de resistencia cruzada frente a otras tecnologías de conservación como los tratamientos térmicos, o frente a antibióticos como aminoglucósidos, betalactámicos, quinolonas y tetraciclinas. La secuenciación genómica de las variantes genéticas resistentes permitió identificar las mutaciones seleccionadas a través de los ensayos de evolución frente a los AE y CI. Estas modificaciones genéticas fueron localizadas en reguladores transcripcionales relacionados con la respuesta celular al estrés oxidativo (soxR yfhP), enzimas relacionadas con la síntesis y reparación de las membranas celulares (accA, lmo1647), proteínas receptoras y de transporte de membrana (fepA, nirC, trkA) y diversas enzimas metabólicas (aroC, hepT, nirB), entre otras. Cabe destacar que las variaciones genéticas localizadas en soxR revelaron ser una de las principales causas del aumento de resistencia y tolerancia frente a los AE y CI, así como de la resistencia cruzada frente a antibióticos. De esta manera, se confirma el importante papel del estrés oxidativo en el mecanismo de inhibición e inactivación de estos antimicrobianos y se señala a las envolturas celulares como una de las principales estructuras diana de los AE y CI, así como de las diferentes tecnologías de conservación de los alimentos frente a las que se observó resistencia cruzada. Por otro lado, el incremento de resistencia y tolerancia frente a AE se mantuvo e incluso fue mayor en un alimento modelo, leche desnatada, revelando el riesgo microbiológico que puede suponer la aparición de variantes resistentes en la cadena alimentaria. De forma complementaria al objetivo principal, se evaluó el empleo de técnicas de emulsificación y encapsulación con el fin de facilitar y potenciar el empleo de AE y CI como conservantes alimentarios o biocidas. La preparación de nanoemulsiones, con tween 80 y etanol, y encapsulaciones, con zeínas y ciclodextrinas, permitió mejorar la estabilidad y la hidrosolubilidad de los AE y CI manteniendo, e incluso en algunos casos, mejorando sus propiedades antimicrobianas cuando se aplicaron de forma única o combinada con otras tecnologías de conservación, como los tratamientos térmicos o los pulsos eléctricos de alto voltaje. El desarrollo de esta Tesis Doctoral supone la puesta a punto de herramientas para el aislamiento y caracterización de variantes genéticas bacterianas resistentes frente a métodos de conservación de alimentos. Estos estudios, además de evidenciar la aparición de variantes resistentes que pueden llegar a suponer un riesgo alimentario, permiten describir estructuras y rutas metabólicas relacionadas con la resistencia celular y, de tal modo, aportan información sobre los mecanismos de inhibición e inactivación bacteriana, lo que resulta imprescindible para mejorar las estrategias de conservación de los alimentos. En esta Tesis Doctoral se ha abordado el estudio de antimicrobianos naturales, concretamente de AE y sus CI, que pueden ser utilizados individualmente o en procesos combinados en la conservación de alimentos. Los principales resultados de este trabajo se han recogido en un capítulo de libro y 9 artículos científicos, uno de ellos de revisión bibliográfica. El empleo de AE y CI a diferentes concentraciones facilitó el desarrollo de protocolos de aislamiento de variantes resistentes tanto mediante métodos de inhibición como de inactivación microbiana, de forma que pueden ser fácilmente implementados para el estudio de otros métodos de conservación. En este sentido, el diseño experimental puesto a punto en esta tesis doctoral permite dar continuidad a esta línea de investigación en mi grupo de investigación, habiéndose ya iniciado el aislamiento y caracterización de variantes genéticas bacterianas resistentes frente a otros métodos de conservación de los alimentos como el calor, las altas presiones hidrostáticas o los pulsos eléctricos de alto voltaje, etc., y de este modo, profundizando en sus mecanismos de inhibición o inactivación y resistencia bacteriana, así como en las implicaciones que pudieran ocasionar en el ámbito de la Salud Pública.